디지털 PCR을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포의 Xegeneic Murine 모델 및 정량화에서 이식편 대 숙주 질환의 유도 및 채점
Summary
여기서, 우리는 xenogeneic 이식편 대 숙주 질환(xenoGVHD) 모델에서 질병을 유도하고 점수를 매기는 프로토콜을 제시한다. xenoGVHD는 인간 T 세포의 면역 억제를 연구하는 생체 내 모델을 제공한다. 추가적으로, 우리는 면역 억제를 정량화하는 공구로 디지털 PCR를 가진 조직에서 인간 적인 T 세포를 검출하는 방법을 기술합니다.
Abstract
급성 이식편 대 숙주 질환(GVHD)은 혈액학적 결핍 및 악성 종양에 대한 치료로서 조혈 줄기 세포 이식을 받는 환자에게 상당한 제한이다. 급성 GVHD는 공여자 T 세포가 외국 항원으로 숙주 조직을 인식하고 숙주에게 면역 반응을 장착할 때 발생한다. 현재 처리는 감염과 재발에 영향을 받기 쉬운 환자를 렌더링하는 유독한 면역 억제 약을 관련시킵니다. 따라서, 기증자 T 세포를 효과적으로 표적으로 하고 부작용을 감소시킬 수 있는 급성 GVHD 치료를 제공하기 위한 연구가 진행 중이다. 이 전 임상 작업의 대부분은 생체 내 시스템에서 뮤린 세포보다는 인간 세포에 면역 억제 요법의 테스트를 허용 하는 xenogenic GVHD (xenoGVHD) 뮤린 모델을 사용 합니다. 이 프로토콜은 xenoGVHD를 유도하는 방법과 일관된 결과를 보장하기 위해 임상 점수를 장님과 표준화하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 이 프로토콜은 마우스 조직에 있는 인간 적인 T 세포를 검출하기 위하여 디지털 PCR를 사용하는 방법을 기술합니다, 이후에 시험된 치료의 효험을 정량화하기 위하여 이용될 수 있는. xenoGVHD 모델은 GVHD 요법을 테스트하는 모델뿐만 아니라 인간 T 세포를 억제 할 수있는 모든 치료법을 제공하며, 이는 많은 염증성 질환에 적용 될 수 있습니다.
Introduction
동종 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)은 가난한 예후를 가진 백혈병과 같은 혈액학적 악성 종양으로 고통받는 환자를 위한 일상적인 처리가 되었습니다. HSCT의 중요한 합병증은 급성 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)입니다. 2012년의 한 연구에서는 급성 GVHD가 형제 기증자로부터 이식을 받는 HSCT 환자의 39%와 관련없는기증자로부터 이식을 받는 환자의 59%에서 개발되었다고 보고했습니다 1. 급성 GVHD는 기증자 유래 T 세포가 수령인의 장기를 공격할 때 발생합니다. GVHD에 대한 유일한 성공적인 치료법은 매우 독성이 높고 감염 및 종양 재발의 위험을 증가시키는 고면역 억제 제2로 치료하는 것입니다. 따라서, 최근 몇 년 동안 급성 GVHD 생존에서 이루어진 개선에도 불구하고 3,4,5,장기 완화를 촉진하는 최소한의 독성으로 개선된 GVHD 요법에 대한 중요한 필요성이 여전히 존재한다.
다음 방법의 전반적인 목표는 xenogeneic GVHD (xenoGVHD)를 유도하고 점수를 매기는 것입니다. xenoGVHD 모델은 임상 시험 6에 전임상 GVHD 연구를 보다 직접적으로 번역할 수 있도록 뮤린 세포가아닌 인간 세포로 급성 GVHD를 유도하는 도구로 개발되었다. 이 모형은 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 SUBlethally 조사되는 NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) 마우스로 주입하는 것을 관련시킵니다. 주입된 인간 T 세포는 인간 항원 제시 세포(APC)에 의해 활성화되어 뮤린 항원과 활성화된 T세포가 전신 염증을 초래하고 궁극적으로 사망하는 먼 조직으로 이동한다 6,7, 8개 , 9개 , 10. xenoGVHD 모델의 질병 병리학 및 진행은 인간의 급성 GVHD를 밀접하게 모방합니다. 구체적으로, 병원성 인간 T 세포는 인간 GVHD6,9에서T 세포 동모활성과 유사한 뮤린 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질에 반응한다. 마우스 MHC 불일치 모델, 다른 널리 사용되는 GVHD 모델에 비해 xenoGVHD 모델의 주요 장점은, 뮤린 세포보다는 인간 세포에 대한 치료법의 테스트를 허용한다. 이것은 인간 세포를 표적으로 하기 위하여 만들어지기 때문에 어떤 수정도 없이 진료소에 직접 번역될 수 있는 제품의 시험을 허용합니다. 최근, 이 모델은 급성 GVHD에 대한 잠재적 치료제로서 인간 항-IL-2항체(11),인간 흉선 조절 T 세포(Tregs)12 및 인간 중간엽 줄기세포(13)를 시험하는데 사용되고 있다. 더 넓은 맥락에서, 이 모델은 인간 T 세포 활성을 억제할 수 있는 임의의 약물 또는 세포 유형에 대한 생체내 억제 분석법으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Stockis et al.14는 xenoGVHD 모델을 사용하여 생체 내 트레그 억제 활성에 대한 인테그린 αVβ8 차단 효과를 연구하였다. 따라서, xenoGVHD 모델은 생체 내 설정에서 T 세포를 표적화하는 임의의 치료의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
이 프로토콜에 기재된 추가방법은 디지털 중합효소 연쇄 반응(dPCR)을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포를 검출하는 방법이다. 이 방법의 목표는 표적 조직에서 T 세포의 이동 및 증식을 정량화하는 도구를 제공하는 것이며, 이는 이 모델에서 시험되는 면역 억제 요법의 효능을 측정하는 것입니다. dPCR은 핵산(15)의 정량화를위한 비교적 새로운 방법이다. 간단히, PCR 반응 혼합물은 타겟 서열의 작은 숫자를 포함하는 파티션으로 분할또는 전혀 타겟이 없다. 표적 서열은 DNA 인터컬레이터 염료 또는 형광 표적 특이적 프로브를 사용하여 증폭및 검출된다. dPCR은 양극분할및 푸아송통계의 분수에 기초하여 대상 시퀀스의 사본 수를 정량화한다15,16. dPCR로 T 세포를 검출하는 것은 유세포 분석 및 조직학을 포함하여 다른 대체 방법에 비해 훨씬 적은 조직을 필요로 하며, 동결 또는 고정 된 조직에서 수행 될 수있다. dPCR은 복사 번호를 결정하기 위해 표준 곡선이 필요하지 않으며 기술 복제가 필요하지 않습니다. 이는 기존의 정량적 PCR(qPCR)16에비해 dPCR에 필요한 시약 및 템플릿 DNA의 양을 감소시킨다. PCR 반응을 dPCR에서 하위 반응으로 분할하는 것은 효과적으로 타겟17을집중시다. 따라서, dPCR은 주로 다량의 비표적 DNA에서 희귀 표적을 검출하기 위한 도구이다. 예를 들어, dPCR은우유(18)에서세균 오염을 검출하고, 에스트로겐 수용체 유전자(19)에서 드문 돌연변이를 식별하고, 환자의 혈액에서 순환 종양 DNA를 검출하는 데 사용된다(20). 이 프로토콜에서, dPCR은 xenoGVHD를 가진 마우스의 조직에서 인간 T 세포를 검출하고 정량화하기 위한 효율적인 도구역할을 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
질병 진행은 일반적으로 xenoGVHD 모델에서 일관적이며, 다른 공여자로부터 PBMC를 주사하더라도, 그래서 여러 실험을 결합할 수 있다. 이러한 일관성을 유지하는 데 필요한 주요 단계는 적절한 즉 주입 기술, 눈가리개 및 일관된 점수입니다. Nervi 등25에 의한 연구는 정맥 꼬리 정맥 주사에 비해, PBMC의 복고풍 궤도 주사가 더 일관된 생착과 더 심한 GVHD 귀착되었다는 것을 보여주었습…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이러한 실험에 사용되는 디지털 PCR 기계를 제공하고 제공되는 기술 지원을 위해 Lane Christenson의 실험실을 인정하고 싶습니다. 또한 토마스 양키 박사님의 지도와 멘토링에 감사드립니다. 이러한 연구는 트립 가족 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| 1.5 mL eppendorf tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 mL serological pipet | VWR International | 89130-898 | |
| 10mL BD Vacutainers – Green capped with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 366480 | |
| 250 µL Ranin pipette tips | Rainin | 17001118 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| 50 mL conical tube | VWR International | 89039-656 | |
| 96-Well ddPCR plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Optional |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 6818 | |
| Anesthesia Chamber | World Precision Instruments | EZ-178 | Provided by animal facility |
| Anesthesia Machine | Parkland Scientific | PM1002 | Provided by animal facility |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367281 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864007 | |
| DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O | Life Technologies | 1811318 | |
| Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | 45001750 | |
| Insulin Syringe | Fisher Scientific | 329424 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | Provided by animal facility |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mouse Irradiator Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC 1 | Holds up to 11 mice |
| Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| P1000 pipetman | MidSci | A-1000 | |
| P200 pipetman | MidSci | A-200 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad | 1814040 | |
| Pipetaid Gilson Macroman | Fisher Scientific | F110756 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| qPCR plates | VWR International | 89218-292 | |
| QX200 Droplet Digital PCR System | Bio-Rad | 12001925 | Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications |
| QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| RNase and DNase-free plate seal | Thermo Scientific | 12565491 | |
| RPMI Advanced 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply) | Fisher Scientific | 67522 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 21040CV | |
| Sterile reservoir | VWR International | 89094-662 | |
| Surgial Scissors | Kent Scientific | INS600393-4 | |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650914-4 |
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