אינדוקציה והבקיע של מחלת השתל מול מארחים ב מודל Murine מורה Xenoic ו כימות האדם תאים T ברקמות העכבר באמצעות PCR דיגיטלי
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום ולצבור מחלות ב-xenogeneic השתל-מול-מארח (Xenogeneic) מודל. xenoGVHD מספק מודל vivo כדי ללמוד דיכוי חיסוני של תאים האדם T. בנוסף, אנו מתארים כיצד לזהות תאים האדם T ברקמות עם PCR דיגיטלי ככלי כדי לכמת את הדיכוי החיסוני.
Abstract
השתל חריפה לעומת מארחים (GVHD) היא מגבלה משמעותית עבור חולים המקבלים השתלת תא גזע המטופאות כטיפול בליקויים המטולוגיים וממאירות. GVHD חריפה מתרחשת כאשר תאים התורם T לזהות רקמות מארח כמו אנטיגן זר והר תגובה חיסונית למארח. הטיפולים הנוכחיים כוללים תרופות מדכאים חיסוני רעיל הרינדור חולים הרגישים זיהום והישנות. כך, יש מחקר מתמשך כדי לספק טיפול GVHD חריפה שיכולים ביעילות למקד את תאי התורם T ולהפחית תופעות לוואי. הרבה מהעבודה הפרה-קלינית הזאת משתמשת במודל ה-GVHD (xenoGVHD) המאפשר בדיקה של טיפולים חיסוניים מדכאים על תאים אנושיים במקום תאים מורניים במערכת vivo. פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרום ל-xenoGVHD וכיצד לעוור ולתקנן ניקוד קליני כדי להבטיח תוצאות עקביות. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש ב-PCR דיגיטלי כדי לזהות תאי T אנושיים ברקמות העכבר, אשר יכול לאחר מכן לשמש לכמת את היעילות של טיפולים נבדק. מודל xenoGVHD לא רק מספק מודל לבדוק טיפולים GVHD אבל כל טיפול שיכול לדכא את תאי T האדם, אשר לאחר מכן ניתן להחיל על מחלות דלקתיות רבות.
Introduction
להשתלת תא גזע המטמית (HSCT) הפכה לטיפול שגרתי עבור חולים הסובלים ממאירות המטולוגית כגון לוקמיה עם פרוגנוזה גרועה. סיבוך משמעותי של HSCT הוא השתל חריפה-מול-מארחים מחלה (GVHD). מחקר 2012 דיווחו כי GVHD חריפה שפותחה ב 39% מהחולים HSCT לקבל השתלות מתורמים אח ו 59% של חולים שקיבלו השתלות מתורמים שאינם קשורים1. GVHD חריפה מתרחשת כאשר התורם נגזר תאים T לתקוף איברים של המטופל. הטיפול המוצלח היחיד עבור GVHD הוא טיפול עם תרופות מדכאים חיסוני מאוד2, אשר רעילים מאוד להגדיל את הסיכון לזיהום והישנות הגידול. לפיכך, למרות שיפורים שנעשו בהישרדות gvhd חריפה בשנים האחרונות3,4,5, יש עדיין צורך חיוני עבור טיפולים משופרים של gvhd עם רעילות מינימלית המקדמים הפוגה ארוכת טווח.
המטרה הכוללת של השיטות הבאות היא לגרום ולהבקיע xenogeneic GVHD (Xenogeneic). מודל xenoGVHD פותחה ככלי כדי לגרום GVHD חריפה עם תאים אנושיים במקום תאים מורטין המאפשר תרגום ישיר יותר של מחקר GVHD מראש קליני ניסויים קליניים6. מודל זה כולל הזרקת באופן מובהק את התאים האנושיים היקפיים (PBMC) לתוך עכברים-SCID IL-2Rγnull (NSG) עכבר כי הם לקרינה משנית. מוזרק האדם תאים t מופעלים על ידי האדם אנטיגן הצגת תאים (apcs) הצגת אנטיגן murine ואת התאים הפעילים T להעביר לרקמות רחוקות וכתוצאה מכך דלקת מערכתית בסופו של דבר מוות6,7, בן שמונה , מיכל בן 10 , 10. המחלה פתולוגיה והתקדמות במודל xenoGVHD הדוק מקרוב האדם gvhd אקוטי. באופן ספציפי, התאים האנושיים T הפתוגניים הם מגיבים מערכת מורכבים היסטורתתאימות (mhc) חלבונים, אשר דומה לפעילות ה-alloreactivity של האדם gvhd6,9. היתרון העיקרי של מודל xenoGVHD מעל מודל התנגשות MHC העכבר, מודל GVHD בשימוש נרחב, הוא מאפשר בדיקות של טיפולים על תאים אנושיים ולא תאים מורקיים. זה מאפשר בדיקות של מוצרים שיכולים ישירות להיות מתורגם למרפאה ללא כל שינוי כי הם עשויים למקד את התאים האנושיים. לאחרונה, מודל זה נעשה שימוש כדי לבדוק את האדם anti-IL-2 נוגדן11, הגוף הרגיל הרתי T תאים (tregs)12 ותאי גזע mesenchymal אנושי13 כטיפולים פוטנציאליים עבור gvhd חריפה. בהקשר רחב יותר, מודל זה יכול לשמש כvivo לדיכוי של כל סוג של סם או תא שיכול לדכא את פעילות תא T האנושית. לדוגמה, Stockis ואח ‘14 השתמשו במודל xenoGVHD כדי ללמוד את ההשפעה של חסימת אינטגרציה αVβ8 על פעילות מדכאים treg ב vivo. כך, מודל xenoGVHD יכול לספק תובנה לתוך המנגנון של כל תרפיה לכוון תאים T ב vivo הגדרה.
שיטה נוספת המתוארת בפרוטוקול זה היא כיצד לזהות תאי T אנושיים ברקמות העכבר באמצעות תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלי (dPCR). המטרה של שיטה זו היא להציע כלי כדי לכמת הגירה והתפשטות של תאים T ברקמות היעד, אשר למדוד את היעילות של טיפולים חיסוניים מדכאים נבדק במודל זה. dPCR היא שיטה מקורית יחסית לקוונפיקציה של חומצות גרעין15. בקצרה, תערובת התגובה של ה-PCR מחולקת למחיצות המכילות מספר קטן של רצף היעד או ללא מטרה כלל. רצף היעד הוא לאחר מכן מוגבר וזוהה באמצעות צבעי DNA intercalating או היעד הספציפי המטרה-בדיקות ספציפיות. dpcr ככמת את מספר העותקים של רצף היעד בהתבסס על שבריר של מחיצות חיוביות וסטטיסטיקה של פואסון15,16. זיהוי תאים T עם dPCR דורש רקמות הרבה פחות לעומת שיטות חלופיות אחרות, כולל הזרמת cy, היסטולוגיה, וניתן לבצע על הרקמות קפוא או קבוע. dPCR אינו דורש עיקול רגיל כדי לקבוע מספרי עותקים, וגם לא משכפל טכני. זה מפחית את כמות ה-DNA של התבנית ואת התבניות הדרושות עבור dPCR בהשוואה ל-PCR כמותי מסורתי (qPCR)16. חלוקת תגובת ה-PCR לתגובות משנה ב-dPCR ביעילות מתמקדת במטרות17. לפיכך, dPCR הוא בעיקר כלי לזיהוי מטרות נדירות בכמות גדולה של דנ א שאינו מטרה. לדוגמה, dPCR משמש כדי לזהות זיהום חיידקי בחלב18, לזהות מוטציות נדירות בגן קולטן אסטרוגן19, ולזהות במחזור DNA גידול בדם של חולים20. בפרוטוקול זה, dPCR משמש כלי יעיל לזיהוי וכימות האדם בתאי T ברקמות של עכברים עם xenoGVHD.
Protocol
Representative Results
Discussion
התקדמות המחלה היא עקבית בדרך כלל במודל xenoGVHD, אפילו עם הזרקה של התורמים שונים, כך ניסויים מרובים ניתן לשלב. השלבים העיקריים הנדרשים כדי לשמור על עקביות זו הם שיטת הזרקת העירוי הנכונה, מסנוור ועקבי הניקוד. מחקר של Nervi ואח ‘25 הפגינו כי בהשוואה הזרקת וריד הזנב, הזרקות רטרו מסלולית ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
היינו רוצים להכיר את המעבדה של ליין Christenson לספק את מכונת ה-PCR הדיגיטלי המשמש ניסויים אלה ועל התמיכה הטכנית סיפק. אנחנו רוצים גם להודות לד ר תומס יאנקי על הדרכתו והמנטורה שלו. מחקרים אלה תמכו בקרן משפחת טריפ.
Materials
| 1.5 mL eppendorf tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 mL serological pipet | VWR International | 89130-898 | |
| 10mL BD Vacutainers – Green capped with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 366480 | |
| 250 µL Ranin pipette tips | Rainin | 17001118 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| 50 mL conical tube | VWR International | 89039-656 | |
| 96-Well ddPCR plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Optional |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 6818 | |
| Anesthesia Chamber | World Precision Instruments | EZ-178 | Provided by animal facility |
| Anesthesia Machine | Parkland Scientific | PM1002 | Provided by animal facility |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367281 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864007 | |
| DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O | Life Technologies | 1811318 | |
| Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | 45001750 | |
| Insulin Syringe | Fisher Scientific | 329424 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | Provided by animal facility |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mouse Irradiator Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC 1 | Holds up to 11 mice |
| Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| P1000 pipetman | MidSci | A-1000 | |
| P200 pipetman | MidSci | A-200 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad | 1814040 | |
| Pipetaid Gilson Macroman | Fisher Scientific | F110756 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| qPCR plates | VWR International | 89218-292 | |
| QX200 Droplet Digital PCR System | Bio-Rad | 12001925 | Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications |
| QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| RNase and DNase-free plate seal | Thermo Scientific | 12565491 | |
| RPMI Advanced 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply) | Fisher Scientific | 67522 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 21040CV | |
| Sterile reservoir | VWR International | 89094-662 | |
| Surgial Scissors | Kent Scientific | INS600393-4 | |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650914-4 |
References
- Jagasia, M., et al. Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation. Blood. 119 (1), 296-307 (2012).
- Bolanos-Meade, J., et al. Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802. Blood. 124 (22), 3221-3227 (2014).
- Gooley, T. A., et al. Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Hahn, T., et al. Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).
- Khoury, H. J., et al. Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era. Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).
- King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical & Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
- Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells. Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).
- Ito, R., et al. Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice. Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).
- Kawasaki, Y., et al. Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).
- Ito, R., et al. A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8. T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).
- Trotta, E., et al. A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism. Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).
- Dijke, I. E., et al. Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells. American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).
- Huang, F., et al. Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals. Frontiers in Immunology. 8, 68 (2017).
- Stockis, J., et al. Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18 (4), (2018).
- Sykes, P. J., et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Ma, H., et al. Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR. Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).
- Vitale, S. R., et al. An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA. Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).
- Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies. Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).
- Weisdorf, D. J., et al. Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).
- Nervi, B., et al. Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice. Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).
- Leon-Rico, D., et al. Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice. LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype. PLoS One. 7 (8), e44219 (2012).
- van Rijn, R. S., et al. A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice. Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).
- Wunderlich, M., et al. OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues. Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).
- Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).
- Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation?. Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).
