Isolamento de glomérulos e In Vivo de rotulagem das proteínas de superfície celular Glomerular
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para murino na vivo rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular com biotina. Este protocolo contém informações sobre como perfundir os rins do rato, isolar glomérulos e executar endógena imunoprecipitação da proteína de interesse.
Abstract
Proteinúria resulta do rompimento do filtro glomerular que é composto o endotélio fenestrado, membrana basal glomerular e podócitos com seus diafragmas de fenda. A estrutura delicada do filtro glomerular, especialmente o diafragma de fenda, baseia-se sobre a interacção das proteínas de superfície celular diversos. Estudar estas proteínas de superfície celular até agora tem sido limitada a estudos em vitro ou análise histológica. Aqui, apresentamos um biotinylation murino na vivo rotulagem método, que permite o estudo de proteínas de superfície celular glomerular sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Este protocolo contém informações sobre como perfundir os rins do rato, isolar glomérulos e executar imunoprecipitação endógena de uma proteína de interesse. Semi quantificação da abundância de superfície celular glomerular é prontamente disponível com este novo método e todas as proteínas acessíveis à perfusão de biotina e imunoprecipitação pode ser estudada. Além disso, o isolamento de glomérulos com ou sem biotinylation mais permite análise da glomerular RNA e proteína, bem como a cultura de células glomerular primária (ou seja, cultura de células primárias podocyte).
Introduction
Proteinúria é uma marca registrada de lesão glomerular e acompanha geralmente o rompimento do filtro glomerular1. O filtro glomerular é composto o endotélio fenestrado, membrana basal glomerular e podócitos. A delicada estrutura molecular do filtro glomerular é altamente dinâmico e sujeito a proteína de superfície celular tráfico de ambos os rins saudáveis e doentes,2,3,4,5,6 . Endocitose de proteínas de superfície celular tem demonstrado ser essencial para a sobrevivência dos podócitos7. Nefrina e podocalyxin são proteínas transmembrana expressadas em podócitos. Nefrina é a espinha dorsal do diafragma fenda glomerular, enquanto podocalyxin é um sialoglycoprotein revestimento os processos secundários pé de podócitos8,9,10. Endocítica tráfico tem sido mostrado anteriormente para Nefrina podocalyxin3,11,12,13,e14.
O melhor de nosso conhecimento, endocitose das proteínas de superfície celular ainda não foi descrita em células endoteliais glomerulares na literatura. No entanto, as células endoteliais expressam em geral todas as proteínas necessárias para os diferentes tipos de endocitose (ou seja, dependente da jangada, dependente de Clatrina endocitose)15,16. Portanto, a célula endotelial tráfico de superfície pode ser estudado com esse método, usando, por exemplo, vascular endothelial (VE)-caderina e molécula de adesão intracelular (ICAM-2), como uma célula de superfície proteínas marcador para células endoteliais glomerulares17 .
Infelizmente, não há nenhum modelo exato em vitro para o delicado filtro glomerular em três camadas no qual célula tráfico de proteína pode ser estudado. O objetivo desse método é, portanto, para estudar proteína glomerular de tráfico na vivo. Além disso, este protocolo contém informações sobre como isolar os glomérulos, permitindo ainda mais a análise do RNA, proteínas ou células glomerular. Semelhante isolamento glomerular técnicas têm sido descritas por diferentes grupos de18,19.
Anteriormente, nós e os outros têm usado ex vivo rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular por biotinylation2,3,4,20,21. No entanto, neste método ex vivo , glomérulos isolados foram expostos ao estresse mecânico, que pode influenciar o tráfico endocítica. Alternativamente, imunofluorescência rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular tem sido usado extensivamente na literatura2,20,22. Com este método, no entanto, apenas um pequeno número de proteínas pode ser analisado dentro de um slide, e quantificação das imagens de imunofluorescência é muitas vezes difícil.
Este método de romance na vivo oferece uma ferramenta confiável para estudar células glomerulares proteína abundância e tráfico com precisão em saudáveis e doentes os rins, e pode ser usada como um complemento para testes de imunofluorescência.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método apresentado permite isolamento bem sucedido de glomérulos para investigar glomerular RNA ou proteína. Além disso, culturas de células glomerular primária podem ser realizadas de glomérulos isolados. Se biotina é aplicada antes de isolamento glomerular, rotulagem das proteínas de superfície celular glomerular pode ser executada. Com este método, na vivo celular glomerular proteína tráfico pode ser estudado, e semi quantificação da abundância de proteína é possível. Os passos mais crít…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Blanka Duvnjak pela sua assistência técnica excepcional. Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 para M.W. e QU280/3-1 para QI. O financiador não tiveram nenhum papel no projeto de estudo, coleta de dados, análise de dados, a decisão de publicar e preparação do manuscrito.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
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