Isolement des glomérules et In Vivo , marquage des protéines de Surface de cellules glomérulaire
Summary
Nous présentons ici un protocole pour l’étiquetage des murins in vivo des protéines de surface de cellules glomérulaire avec de la biotine. Ce protocole contient des informations sur la façon de perfuse les reins de souris, isoler les glomérules et effectuer d’immunoprécipitation endogène de la protéine d’intérêt.
Abstract
Protéinurie résulte de la rupture du filtre glomérulaire qui est composé de l’endothélium fenêtrée, membrane basale glomérulaire et podocytes avec leurs membranes de fente. La structure délicate du filtre glomérulaire, en particulier le diaphragme de fente, s’appuie sur l’interaction entre les protéines de surface de diverses cellules. Étudier ces protéines de surface de cellules a été jusqu’à présent limitée à des études in vitro ou l’analyse histologique. Nous présentons ici une biotinylation murine en vivo étiquetage méthode, ce qui permet l’étude des protéines de surface de cellules glomérulaire dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Ce protocole contient des informations sur la façon de perfuse les reins de souris, isoler les glomérules et effectuer d’immunoprécipitation endogène d’une protéine d’intérêt. La détermination semi-quantitative de l’abondance de surface cellulaire glomérulaire est disponible avec cette nouvelle méthode et toutes les protéines accessibles à la perfusion de biotine et immunoprécipitation peut être étudiée. En outre, isolement des glomérules avec ou sans biotinylation permet davantage l’analyse de RNA glomérulaire et protéines, mais aussi la culture primaire de cellules glomérulaire (c.-à-d., culture de cellules primaires podocyte).
Introduction
Une protéinurie est une caractéristique des lésions glomérulaires et accompagne habituellement les perturbations du filtre glomérulaire1. Le filtre glomérulaire est composé de l’endothélium fenêtrée et membrane basale glomérulaire podocytes. La délicate structure moléculaire du filtre glomérulaire est très dynamique et soumise à la protéine de surface cellulaire traite les deux reins sains et malades,2,3,4,5,6 . Endocytose des protéines de surface cellulaire s’est avéré essentiel pour la survie des podocytes7. Néphrine et podocalyxin sont des protéines transmembranaires exprimées sur les podocytes. Néphrine est l’épine dorsale de la membrane glomérulaire fente, tandis que podocalyxin est une sialoglycoprotéine revêtements le pied secondaire des podocytes8,9,10. Trafic d’endocytose a déjà démontré pour néphrine et podocalyxin3,11,12,13,14.
Au meilleur de nos connaissances, l’endocytose des protéines de surface cellulaire n’a pas encore été décrite dans les cellules endothéliales glomérulaires dans la littérature. Cependant, les cellules endothéliales expriment en général toutes les protéines nécessaires pour les différents types d’endocytose (c.-à-d. l’endocytose clathrine dépendant, dépendante du radeau)15,16. Donc, le trafic de surface de cellules endothéliales peut être étudié avec cette méthode en utilisant, par exemple, vasculaire endothéliale (VE)-cadhérine et la molécule d’adhérence intracellulaire (ICAM-2) comme une cellule de surface protéine marqueur pour les cellules endothéliales glomérulaire17 .
Malheureusement, il n’y a aucun modèle précis in vitro pour le filtre glomérulaire trois couches délicat dans quelle cellule traite de la protéine de surface peut être étudiée. L’objectif de cette méthode est donc d’étudier protéine glomérulaire traite en vivo. En outre, ce protocole contient des informations sur la façon d’isoler les glomérules, permettant ainsi des analyses glomérulaire ARN, protéines ou cellules plus loin. Un isolement glomérulaire similaire techniques ont été décrites par différents groupes18,19.
Auparavant, nous et autres avons utilisé ex vivo marquage des protéines de surface de cellules glomérulaire par biotinylation2,3,4,20,21. Toutefois, cette méthode ex vivo , glomérules isolés ont été exposés à des contraintes mécaniques, qui peuvent influer sur le trafic endocytose. Alternativement, l’immunofluorescence marquage des protéines de surface de cellules glomérulaires a largement été utilisé dans la littérature2,20,22. Avec cette méthode, toutefois, seul un petit nombre de protéines peut être analysé dans une diapositive et analyse quantitative d’images d’immunofluorescence est souvent difficile.
Cette méthode novatrice en vivo propose un outil fiable pour étudier les cellules glomérulaires protéine de surface abondance et traite avec précision en sains et malades reins, et il peut être utilisé comme un ajout aux tests d’immunofluorescence.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée permet la réussite de l’isolement des glomérules d’enquêter glomérulaire ARN ou protéine. En outre, les cultures primaires de cellules glomérulaires peuvent être effectuées depuis les glomérules isolés. Si biotine est appliqué avant l’isolement glomérulaire, marquage des protéines de surface de cellules glomérulaire peut être effectuée. Avec cette méthode, in vivo des cellules glomérulaires traite des protéine de surface peut être étudiée, et la détermination …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Blanka Duvnjak pour son aide technique exceptionnel. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 à M.W. et QU280/3-1 à Q.I. Le bailleur de fonds n’avait aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données, analyse des données, décision de publier et préparation du manuscrit.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
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