Isolatie van de Glomeruli en In Vivo Labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het lymfkliertest in vivo labelen van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten met biotine. Dit protocol bevat informatie over hoe perfuse muis nieren, het isoleren van de glomeruli, en het uitvoeren van endogene immunoprecipitation van de proteïne van belang.
Abstract
Proteïnurie vloeit voort uit de verstoring van het glomerulaire filter dat is samengesteld uit de fenêtré endotheel, glomerulaire kelder-membraan en podocytes met hun gleuf pessarium. De fijne structuur van de glomerulaire filter, met name de gleuf membraan, dat is afhankelijk van het samenspel van verschillende cel oppervlakte-eiwitten. Het bestuderen van deze cel-oppervlakte-eiwitten tot nu toe beperkt gebleven voor in vitro studies of histologische analyse. Hier presenteren we een lymfkliertest in vivo biotinylation labeling methode, waarmee de studie van de oppervlakte eiwitten glomerulaire cel onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Dit protocol bevat informatie over hoe perfuse muis nieren, het isoleren van de glomeruli, en het uitvoeren van endogene immunoprecipitation van een proteïne van belang. Halve kwantificatie van glomerulaire cel oppervlakte overvloed is beschikbaar met deze nieuwe methode, en alle eiwitten toegankelijk voor Biotine perfusie en immunoprecipitation kan worden bestudeerd. Bovendien, kan isolatie van de glomeruli met of zonder biotinylation verdere analyse van de glomerulaire RNA en eiwitten, evenals primair glomerulaire celkweek (dat wil zeggen, primaire podocyte celcultuur).
Introduction
Proteïnurie is een kenmerk van de glomerulaire letsel en meestal begeleidt verstoring van de glomerulaire filter1. Het glomerulaire filter is samengesteld uit de fenêtré endotheel, glomerulaire kelder-membraan en podocytes. De delicate moleculaire structuur van de glomerulaire filter is zeer dynamisch en onderhevig is aan cel oppervlakte-proteïne handel in beide gezonde en zieke nieren2,3,4,5,6 . Endocytose van cel oppervlakte-eiwitten is gebleken te zijn essentieel voor de overleving van de podocytes7. Nephrin en podocalyxin zijn transmembraan eiwitten uitgedrukt op podocytes. Nephrin is de ruggengraat van het middenrif glomerulaire gleuf, terwijl podocalyxin een coating van de voet van de secundaire processen van podocytes8,9,10sialoglycoprotein. Endocytotische handel eerder gebleken voor nephrin en podocalyxin3,11,12,13,14.
Tot de beste van onze kennis, is endocytose van cel oppervlakte-eiwitten niet nog is beschreven in glomerulaire endotheliale cellen van de literatuur. Echter uiting endotheliale cellen in het algemeen alle nodige eiwitten voor de verschillende soorten endocytose (dat wil zeggen, afhankelijk van de clathrin, vlot-afhankelijke endocytose)15,16. Daarom endothelial cel oppervlakte mensenhandel kan worden bestudeerd bij deze methode gebruikt, bijvoorbeeld, vasculaire endothelial (VE)-cadherine en intracellulaire adhesie molecuul (ICAM-2) als een cel oppervlak marker eiwitten voor glomerulaire endotheliale cellen17 .
Er bestaat helaas geen nauwkeurige in vitro model voor de delicate drie lagen glomerulaire filter in welke cel de oppervlakte-proteïne mensenhandel kan worden bestudeerd. Het doel van deze methode is dus om te studeren glomerulaire eiwit mensenhandel in vivo. Dit protocol bevat bovendien informatie over het isoleren van de glomeruli, waardoor verdere analyse van de glomerulaire RNA, eiwitten of cellen. Soortgelijke glomerulaire isolatie technieken zijn beschreven door verschillende groepen18,19.
Wij en anderen hebben vroeger ex vivo labeling van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten door biotinylation2,3,4,20,21. Echter, in deze methode ex vivo geïsoleerde glomeruli werden blootgesteld aan mechanische stress, die invloed op endocytotische mensenhandel hebben kan. Als alternatief, immunofluorescentie labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten is uitgebreid gebruikt in de literatuur2,20,22. Met deze methode echter slechts een klein aantal eiwitten binnen één dia kan worden geanalyseerd, en kwantificatie van immunofluorescentie beelden is vaak moeilijk.
Deze roman in vivo -methode biedt een betrouwbaar hulpmiddel om te studeren glomerulaire cel oppervlakte-proteïne overvloed en mensenhandel nauwkeurig in gezonde en zieke nieren, en het kan worden gebruikt als aanvulling op immunofluorescentie proeven.
Protocol
Representative Results
Discussion
De onderhavige methode kan succesvolle Isolatievan glomeruli te onderzoeken glomerulaire RNA of eiwit. Daarnaast kunnen glomerulaire primaire celculturen worden uitgevoerd vanaf de geïsoleerde glomeruli. Als biotine wordt vereffend voor glomerulaire isolatie, kan etikettering van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten worden uitgevoerd. Met deze methode in vivo glomerulaire cel oppervlakte-proteïne mensenhandel kan worden bestudeerd, en semi-kwantificatie van eiwit overvloed is mogelijk. De belangrijkste stappe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Blanka Duvnjak voor haar uitzonderlijke technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 aan de M.W. en IQ QU280/3-1 De funder had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling, gegevensanalyse, besloten tot bekendmaking en voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein–nephrin–is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
