عزل جلوميرولي و في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي
Summary
نقدم هنا بروتوكولا مورين في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي مع البيوتين. هذا البروتوكول يتضمن معلومات عن كيفية نتخلل الكلي الماوس وعزل glomeruli وأداء إيمونوبريسيبيتيشن الذاتية من بروتين الفائدة.
Abstract
بروتينية ناتجة عن تعطيل عامل التصفية الكبيبي الذي يتكون البطانة فينيستراتيد والغشاء الكبيبي، وبودوسيتيس مع أغشية شق بهم. هيكل حساسة لتصفية الكبيبي، لا سيما الشق الحجاب الحاجز، يعتمد على التفاعل بين البروتينات السطحية الخلية المتنوعة. دراسة هذه الخلية البروتينات السطحية كانت حتى الآن محدودة للدراسات في المختبر أو تحليل النسجية. نقدم هنا، بيوتينيليشن مورين في فيفو وسم الأسلوب الذي يتيح دراسة الخلية الكبيبي البروتينات السطحية تحت الظروف الفسيولوجية وباثوفيسيولوجيك. هذا البروتوكول يتضمن معلومات عن كيفية نتخلل الكلي الماوس وعزل glomeruli وأداء إيمونوبريسيبيتيشن الذاتية من بروتين فائدة. كوانتيتيشن شبه خلية الكبيبي السطحية الوفرة متاحة بسهولة مع هذا الأسلوب الرواية، والوصول إلى نضح البيوتين جميع البروتينات ويمكن دراسة إيمونوبريسيبيتيشن. وباﻹضافة إلى ذلك، عزل glomeruli مع أو بدون بيوتينيليشن تمكن مزيد تحليل الكبيبي الجيش الملكي النيبالي والبروتين، فضلا عن ثقافة الخلية الكبيبي الأولية (أي، بودوسيتي الرئيسية الخلية الثقافة).
Introduction
بيله هو السمة مميزة للإصابة الكبيبي، وعادة ما يصاحب اضطراب تصفية الكبيبي1. وتتألف التصفية الكبيبي البطانة فينيستراتيد والغشاء الكبيبي، وبودوسيتيس. التركيب الجزيئي الدقيق لتصفية الكبيبي درجة عالية من الديناميكية ورهنا بروتين سطح الخلية الاتجار في كلا الكليتين صحية والمريضة2،3،،من45،6 . ثبت الالتقام بروتينات السطحية خلية أساسية لبقاء بودوسيتيس7. نيفرين وبودوكاليكسين بالبروتينات ترانسميمبراني أعرب عن بودوسيتيس. نيفرين هو العمود الفقري للغشاء الكبيبي طولية، بينما بودوكاليكسين سيالوجليكوبروتين طلاء العمليات الثانوية سيرا على الأقدام من بودوسيتيس8،،من910. الاتجار اندوسيتيك سابقا وقد تبين نيفرين وبودوكاليكسين3،،من1112،،من1314.
على حد علمنا، الالتقام الخلية البروتينات السطحية قد لا بعد وصفت في خلايا بطانية الكبيبي في الأدب. ومع ذلك، عموما خلايا بطانية التعبير عن جميع البروتينات اللازمة لأنواع مختلفة من الالتقام (أي، تعتمد على كلاثرين، وتعتمد على طوف الالتقام)15،16. ولذلك، قد درس الاتجار بسطح الخلية البطانية بهذا الأسلوب باستخدام، على سبيل المثال، الأوعية الدموية غشائي (هاء)-كادهيرين وجزيء الالتصاق داخل الخلايا (ICAM-2) كخلية سطح البروتين علامة لخلايا بطانية الكبيبي17 .
ولسوء الحظ، ليس هناك دقيقة في المختبر نموذج لحساسة الطبقات الثلاث الكبيبي عامل التصفية في الخلية التي يمكن دراستها الاتجار بالبروتين السطحي. والهدف من هذا الأسلوب التالي لدراسة البروتين الكبيبي الاتجار في فيفو. وبالإضافة إلى ذلك، يتضمن هذا البروتوكول معلومات عن كيفية عزل glomeruli، تمكين مزيد من التحليل الكبيبي الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات، أو خلايا. عزل الكبيبي مماثلة قد وصفت التقنيات بمختلف المجموعات18،19.
سابقا، ونحن وآخرون قد استخدمت السابقين فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي بيوتينيليشن2،3،4،،من2021. ومع ذلك، في هذا الأسلوب السابقين فيفو ، تعرضت glomeruli معزولة للإجهاد الميكانيكي، والتي قد تؤثر على الاتجار اندوسيتيك. وبدلاً من ذلك، على نطاق واسع قد استخدم الفلورة وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي في الأدب2،،من2022. مع هذا الأسلوب، ومع ذلك، يمكن تحليلها إلا عدد قليل من البروتينات داخل شريحة واحدة، وكوانتيتيشن الصور الفلورة في كثير من الأحيان صعبة.
يوفر هذا الأسلوب الرواية في فيفو أداة موثوقة لدراسة الخلية الكبيبي البروتين السطحي وفرة والاتجار دقة في صحية ومريضة الكلي، ويمكن استخدامه كإضافة إلى اختبارات الفلورة.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة عرض يتيح نجاح عزل glomeruli للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي الكبيبي أو البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤديها الثقافات الخلية الكبيبي الأولية من glomeruli معزولة. إذا تم تطبيق البيوتين قبل عزلة الكبيبي، يمكن إجراء وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن دراسته…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون بلانكا دوفنجاك لها المساعدة التقنية استثنائية. ودعم هذا العمل Deutsche الأوقيانوغرافية (www.dfg.de) WO1811/2-1 إلى M.W. و QU280/3-1 للذكاء. وكان ممولاً أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات، وتحليل البيانات، وقرار نشر، وإعداد المخطوط.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
References
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein–nephrin–is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
