Summary

Estudio simultáneo de la contratación de las subpoblaciones de monocitos bajo flujo In Vitro

Published: November 26, 2018
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Summary

Aquí, presentamos un protocolo integrado que mide la subpoblación de monocito tráfico bajo flujo in vitro por el uso de marcadores de superficie específicos y microscopía de fluorescencia confocal. Este protocolo puede utilizarse para explorar medidas de reclutamiento secuencial así como a otros subtipos de leucocitos usando otros marcadores de superficie específicos del perfil.

Abstract

El reclutamiento de monocitos de la sangre a los tejidos periféricos específicos es fundamental para el proceso inflamatorio durante la lesión tisular, desarrollo de tumores y enfermedades autoinmunes. Esto se facilita a través de un proceso de captura de flujo libre en la superficie luminal de las células endoteliales activadas, seguido por su migración de adherencia y transendothelial (transmigración) a los tejidos subyacentes afectados. Sin embargo, no se entienden los mecanismos que soportan la contratación preferencial y contextual de las subpoblaciones de monocitos. Por lo tanto, hemos desarrollado un método que permite la contratación de las subpoblaciones de monocitos diferentes para visualizar y medir bajo flujo simultáneamente. Este método, basado en la proyección de imagen confocal Time-lapse, permite la distinción inequívoca entre adherentes y transmigrated monocitos. Aquí, describimos cómo se puede utilizar este método para estudiar simultáneamente la cascada de reclutamiento de monocitos pro-angiogénica y no angiogénico in vitro. Además, este método se puede ampliar para estudiar las distintas etapas de la contratación de un máximo de tres poblaciones de monocitos.

Introduction

Monocitos constituyen un componente fagocitario de la inmunidad innata que es esencial para la lucha contra patógenos, limpieza de los tejidos dañados, angiogénesis y la fisiopatología de muchas enfermedades incluyendo cáncer1,2,3 . Los monocitos son células derivadas de médula ósea, compuestas de subpoblaciones heterogéneas que circulan en la sangre pueden ser reclutadas en el sitio de la inflamación en tejido periférico a través de mecanismos moleculares específicos. Las cascadas de reclutamiento de monocitos, en cuanto a los leucocitos en general, implica diversos pasos incluyendo captura, rodar, gatear, detención, migración transendothelial (transmigración) y migración a través de la pared del vaso (la membrana del sótano y mural células)4. Estos pasos consisten principalmente en inflamación inducida por moléculas en la superficie luminal endotelial selectinas ligandos de glicoproteína, quimiocinas, moléculas de adhesión intercelular y junctional, y sus receptores en los leucocitos como ligandos de selectina y las integrinas. Vías de tráfico a través de las uniones celulares endoteliales (paracelular) o a través del cuerpo de la célula endotelial (transcelular) pueden utilizarse por los leucocitos para atravesar la barrera endotelial5. Mientras que los monocitos se han documentado históricamente a transmigrada a través de la ruta transcelular, se han propuesto posibles divergencias en su camino migratorio como monocitos ya no se consideran una población celular homogénea. Ahora resulta claro que la diversidad de monocitos puede ser definido por cada una de sus diferencias y similitudes, con respecto a su extravasación distintivo cascadas3,6. Por lo tanto, para discriminar claramente entre subpoblaciones de monocitos, es fundamental visualizar y fenotipo el comportamiento de cada una de estas subpoblaciones diferentes durante la contratación del proceso.

Monocitos de humano, cerdo, rata y ratón se subdivide en subpoblaciones fenotípicas con ciertas funciones adscrito y comportamientos migratorios específicos7,8,9. Por ejemplo, en los seres humanos, los monocitos pueden dividirse en tres subconjuntos basados en su superficial expresión de CD14, un correceptor para lipopolisacárido bacteriano y CD16, receptor Fc gamma III. Subpoblaciones de monocitos humanos incluyen CD14 clásico+CD16, intermedio CD14+CD16+ y no clásica CD14dimCD16 células de+ 6,9. El CD14 clásico+CD16 monocitos fueron demostrados para ser principalmente inflamatorias mientras que la piscina de CD16+ monocitos encontraron colectivamente presentar TIE2 expresión proangiogénico función10. Constantemente, la estimulación de células endoteliales con las citoquinas inflamatorias tales como necrosis del tumor humano factor α (TNF) o la interleucina (IL-1) beta (inflamación convencional) sea suficiente para la completa captación de CD14 clásico+CD16 monocitos. Sin embargo, son necesarias para provocar la transmigración de la CD16 acciones simultáneas de A factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y TNFα (inflamación impulsado por factores angiogénicos)+ piscina proangiogénico de monocitos3. Históricamente, el sistema tradicional de Transwell bajo condiciones estáticas, la cámara de flujo paralelo de la placa y las cámaras de flujo μ diapositiva se han utilizado para analizar cuantitativamente el reclutamiento de la población de un leucocito en un tiempo en vitro11 ,12,13. Mientras que estos protocolos se han validado, un método más robusto que permite el análisis simultáneo de varias subpoblaciones de monocitos se consideraría más perspicaz. Esas metodologías deben cuenta para múltiples interacciones y las diferentes frecuencias de cada población respectiva y también proporcionar una comprensión mecanicista de las similitudes y especificidades para las cascadas de reclutamiento que definen cada monocito subconjunto.

Aquí, presentamos un método basado en la proyección de imagen de Time-lapse de reclutamiento de monocitos bajo flujo que permite las cascadas migratorias de subpoblaciones de monocitos diferentes a estudiar simultáneamente mediante el uso de microscopia confocal. Este método integra ciertas características que imitan la inflamación endotelial de la célula, así como la hemodinámica de la circulación de monocitos en vénulas post-capilares, la principal situación de reclutamiento leucocitario en vivo. El método propuesto utiliza células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), que se generan a través de un protocolo bien establecido de aislamiento de cordón umbilical humano. Este recurso clínico tiene la ventaja de ser fácilmente disponibles como subproductos biológicos, mientras que también proporciona un rendimiento razonable de las células endoteliales que pueden ser aisladas de la vena umbilical. También utilizamos tintes fluorescentes y la inmunofluorescencia para distinguir entre los diferentes componentes celulares y la microscopia confocal para definir inequívocamente monocito posicionamiento (luminal y abluminal) con el tiempo. El protocolo que presentamos ha sido desarrollado para medir simultáneamente los niveles de la transmigración de las subpoblaciones de monocitos. Por otra parte, cabe señalar que esta metodología puede ampliarse para estudiar otras subpoblaciones de leucocitos y procesos de selección por medio de diferentes biomarcadores y etiquetado.

Protocol

Materiales humanos fueron utilizados con el consentimiento informado de los donantes voluntarios y de acuerdo con el suizo comités de ética en investigación clínica. 1. aislamiento y congelación de Umbilical humano vena las células endoteliales (HUVEC) Añadir 5 mL de solución de recubrimiento a un matraz T75 (0,1 mg/mL G de colágeno y gelatina de 0.2% en tampón fosfato salino PBS a pH 7.4) durante 30 min a 37 ° C antes de iniciar el aislamiento de HUVEC. Limpiar …

Representative Results

Determinar el estado de activación de HUVEC inducida por el TNFα La bio-actividad de las citoquinas inflamatorias TNFα puede variar según el lote y la reposición del ciclo de congelación-descongelación. Es importante comprobar el estado de activación de HUVEC con tratamiento de TNFα. Esto podría realizarse mediante tinción en paralelo algunas muestras de HUVEC confluente para la inducción inflamatoria de selectinas, ICA…

Discussion

Aquí, Divulgamos un método que detalla un estudio de cómo transmigrada subpoblaciones de monocitos a través de la monocapa de endotelio inflamada. Utiliza el método discutido microscopia confocal en vez de microscopia de contraste de fase, que también se utiliza para el estudio de reclutamiento de monocitos bajo flujo3,11,19. Una ventaja importante del uso de la microscopia confocal para Time-lapse de imágenes es la capac…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Dr. Paul Bradfield manuscrito lectura y retroalimentación. A. S. recibió apoyo financiero de la Sir Jules espina beneficencia ultramar Trust reg.,

Materials

Tissue Culture Flasks 75 cm2 TPP 90076 Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4 IBIDI 80606
Centrifuge Tubes 15 mL TPP 191015
Centrifuge Tubes 50 mL TPP 191050
Collagen G Biochrom L 7213 For coating of cell culture flasks
Gelatin Sigma-Aldrich 1393 For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
3-Way Stopcocks BIO-RAD 7328103
penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml AMIMED 4-02F00-H
Collagenase type 1 Worthington LS004216
Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes GIBCO 22340020
Bovine Albumin Fraction V ThermoFisher 15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg Millipore 02-102
Heparin Sodium Sigma-Aldrich H3149RT
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H6909
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O APPLICHEM A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC Miltenyi Biotech 130-100-713 AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE Miltenyi Biotech 130-110-807 AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC Miltenyi Biotech 130-107-016 AB_2653263
BD Accuri C6 Plus BD Bioscience
µ-Slide I Luer IBIDI 80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) ThermoFisher C2925
Recombinant human TNFα Peprotech 300-01A
Recombinant human VEGFA Peprotech 100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump KF Technology NE-1000
Ficoll Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE Miltenyi Biotech 130-110-519 AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human Miltenyi Biotech 130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE Miltenyi Biotech 130-106-762 AB_2655403
LS columns Miltenyi Biotech 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech 130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate ThermoFisher H1399
Silicone tubing IBIDI 10841
Elbow Luer Connector IBIDI 10802
Female Luer Lock Coupler IBIDI 10823
Luer Lock Connector Female IBIDI 10825
In-line Luer Injection Port IBIDI 10820
Ar1 confocal microscope Nikon
40X objective Nikon 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software NIH

References

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Cite This Article
Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes, T., Wehrle-Haller, B., Sidibé, A. Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58509, doi:10.3791/58509 (2018).

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