Одновременное исследование вербовки Моноцит субпопуляций под поток в пробирке
Summary
Здесь мы представляем Интегрированный протокол, который измеряет Моноцит субпопуляция людьми под потока в пробирке путем использования конкретных поверхностных маркеров и конфокальный флуоресцентной микроскопии. Этот протокол может использоваться для изучения последовательного набора мер, а также относительно профиль другие подтипы лейкоцитов, используя другие конкретные поверхностных маркеров.
Abstract
Набор моноцитов в крови для целевых периферических тканях имеет решающее значение для воспалительного процесса во время повреждения тканей, развитие опухоли и аутоиммунных заболеваний. Этому способствует через процесс захвата от свободного потока на поверхность Люминал активированного эндотелиальных клеток, следуют их адгезии и трансэндотелиальной миграции (переселение) в базовом пораженной ткани. Однако механизмы, которые поддерживают преференциальных и контекстно зависимые вербовки Моноцит субпопуляций понимаются еще не полностью. Таким образом мы разработали метод, который позволяет набора различных Моноцит субпопуляций одновременно визуализировать и измеряется в поток. Этот метод, основанный на покадровой конфокальная томография, позволяет недвусмысленное различие между приверженцами и переселенных моноцитов. Здесь мы описываем, как этот метод может использоваться одновременно изучить набор Каскад pro ангиогенных и не ангиогенных моноцитов в пробирке. Кроме того этот метод может быть продлен изучить различные этапы найма до трех Моноцит населения.
Introduction
Моноциты являются фагоцитирующих компонентом врожденного иммунитета, которая необходима для борьбы с патогенами, очистка поврежденных тканей, ангиогенез и патофизиологии многих заболеваний, включая рак1,2,3 . Моноциты являются клетки костного мозга, полученных состоит из гетерогенных субпопуляций, которые циркулируют в крови, но могут быть набраны на месте воспаления в периферических тканях через конкретные молекулярные механизмы. Набор каскадов моноцитов, а лейкоцитов в целом подразумевает различные шаги, включая захват, прокатки, ползать, арест, трансэндотелиальной миграции (переселение) и миграции через стенку сосуда (базальной мембраны и росписи 4клетки). Эти шаги включают главным образом воспаления индуцированной молекул на поверхности эндотелиальных Люминал селектинов, гликопротеин лигандов, chemokines, молекулы адгезии межклеточных и соединительной и их рецепторов на лейкоциты например селектина лигандами и интегринов. Торговли людьми пути через либо развязок эндотелиальных клеток (параклеточный) или через эндотелиальные клетки тела (transcellular) может использоваться лейкоциты пересечь эндотелиальный барьер5. Хотя исторически были задокументированы моноцитов к высыпками через маршрут transcellular, потенциальные расхождения в их миграционных пути были предложены моноциты больше не считаются популяции однородных клеток. В настоящее время становится ясно, что разнообразие Моноцит могут быть определены каждым из их различий и общности, в отношении их отличительные кровоподтек каскады3,6. Таким образом чтобы однозначно различать Моноцит субпопуляций, крайне важно для визуализации и фенотип поведение каждого из этих различных субпопуляций в ходе набора процесса.
Моноциты от человека, свинки, крысы и мыши были подразделены фенотипического субпопуляции с некоторыми объясняется социальными функциями и конкретных миграционных поведения7,8,9. Например в организме человека, моноциты можно подразделить три подгруппы, основанный на их поверхности выражение CD14, coreceptor для бактериальных липополисахарида и CD16, Fc-гамма-рецептор III. Человека Моноцит субпопуляций включают в себя классические CD14 окрашенных CD16 ++–, промежуточные CD14 окрашенных CD16 +++ и неклассические CD14тускломCD16+ клетки6,9. Классическая CD14 окрашенных CD16 ++– моноцитов были показаны в основном воспалительных тогда как бассейн CD16+ моноцитов коллективно были найдены представить TIE2 выражения и proangiogenic функции10. Последовательно, стимуляции эндотелиальных клеток с воспалительных цитокинов, таких как некроза опухолей человека фактор (ФНО) α или интерлейкина (IL-1) бета (обычные воспаление) достаточно, чтобы вызвать полный набор классических CD14 окрашенных CD16 ++ – моноцитов. Тем не менее, одновременных действий Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и TNFα (ангиогенных факторов driven воспаление) требуются спровоцировать трансмиграции CD16+ proangiogenic бассейн моноциты3. Исторически традиционная система Transwell при статических условиях, Камера потока параллельной пластине и µ слайд потока камеры были использованы для количественного анализа набора одного лейкоцита населения на время в пробирке11 ,12,13. Хотя эти протоколы были подтверждены, более надежный метод, который позволяет одновременный анализ нескольких Моноцит субпопуляций будет считаться более глубокий. Такие методологии должны учитывать различные частоты каждого соответствующего населения и несколько взаимодействий и также предусматривают набор каскадов, которые определяют каждый Моноцит механистического понимания сходства и особенностей подмножество.
Здесь мы представляем метод, основанный на промежуток времени изображений набора Моноцит под поток, который позволяет мигрирующих каскады Моноцит различных субпопуляций одновременно быть изучены с помощью конфокальной микроскопии. Этот метод объединяет некоторых критических функций, которые имитируют эндотелиальных клеток воспаления, а также гемодинамики циркулирующих моноцитов в пост капиллярного венулы, основное место лейкоцита вербовки в естественных условиях. Предложенный метод использует эндотелиальных клеток человека пупочную вену (HUVEC), которые генерируются с помощью устоявшихся Протокол изоляции от человека пуповины. Этот клинический ресурс имеет преимущество легко доступны как побочный продукт биологического, также одновременно обеспечивая разумной доходности эндотелиальных клеток, которые могут быть изолированы от пупочную вену. Мы также использовали флуоресцентных красителей и иммунофлюоресценции для различения различных клеточных компонентов и confocal микроскопии однозначно определить Моноцит позиционирования (люминал против abluminal) с течением времени. Протокол, представленные здесь был разработан одновременно измерить уровни трансмиграции Моноцит субпопуляций. Кроме того следует отметить, что эта методология может быть расширен для изучения других субпопуляций лейкоцитов и процессы набора персонала путем использования различных биомаркеров и маркировки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы приводим метод подробно исследование как Моноцит субпопуляций высыпками через воспаление эндотелия монослоя. Обсудили метод используется confocal микроскопии вместо фазово контрастной микроскопии, который также используется для изучения набора Моноцит под поток3<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Пол Брэдфилд за рукопись чтения и обратными связями. A. S. получил финансовую поддержку от сэра Жюль Торн благотворительных заморских доверять обл.,
Materials
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
- Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
- De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
- Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
- Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
- Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
- Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
- Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
- ibidi GmbH. . Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides – Based on Numerical Calculations. , (2014).
- Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).
- Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).
