Studio simultaneo del reclutamento di sottopopolazioni monocito sotto flusso In Vitro

Monociti costituiscono una componente fagocitica dell’immunità innata che è essenziale per combattere gli agenti patogeni, pulizia di tessuti danneggiati, l’angiogenesi e la fisiopatologia di molte malattie compreso i cancri^1,2,3 . I monociti sono cellule derivate da midollo osseo composte di sottopopolazioni eterogenee che circolano nel sangue, ma possono essere reclutate nel sito di infiammazione nel tessuto periferico attraverso specifici meccanismi molecolari. Le cascate di reclutamento dei monociti, per quanto riguarda i leucociti in generale, implica diversi passaggi tra cui cattura, rotolamento, strisciando, arresto, migrazione transendoteliale (Trasmigrazione) e migrazione attraverso la parete del vaso (membrana dello scantinato e murale di cellule)⁴. Questi passaggi comportano principalmente indotta da infiammazione molecole sulla superficie luminal endoteliale come selectine, glicoproteina ligandi, chemochine, molecole di adesione intercellulare e giunzionale e dei loro recettori sui leucociti quali selectina ligandi e le integrine. Vie di traffico attraverso giunzioni delle cellule endoteliali (paracellular) o attraverso il corpo delle cellule endoteliale (transcellular) possono essere utilizzate dai leucociti di attraversare la barriera endoteliale⁵. Mentre i monociti sono stati documentati storicamente trasmigrano attraverso la via transcellulare, potenziali divergenze nel loro percorso migratorio sono stati proposti come monociti non siano più considerati una popolazione omogenea delle cellule. Ora sta diventando chiaro che la diversità del monocito può essere definito da ciascuna delle loro differenze e somiglianze, per quanto riguarda il loro distintivo stravaso cascate^3,6. Pertanto, al fine di discriminare in modo inequivocabile le sottopopolazioni monocito, è fondamentale per visualizzare ed elaborare di fenotipo il comportamento di ciascuna di queste sottopopolazioni differenti durante il reclutamento.

Monociti da umano, maiale, ratti e topi sono stati suddivisi in sottopopolazioni fenotipiche con determinate funzioni ascritte e specifici comportamenti migratori^7,8,9. Ad esempio, in esseri umani, monociti possono suddividere in tre sottogruppi basati sulla loro superficie espressione di CD14, corecettore per lipopolisaccaride batterico e CD16, il ricevitore di Fc-gamma III. Sottopopolazioni monocito umano includono CD14 classica⁺CD16^–, intermedio CD14⁺CD16⁺ e tronchetti CD14^dimCD16 cellule^{+ 6,9}. Il CD14 classica⁺CD16^– monociti sono stati indicati per essere principalmente infiammatorie mentre la piscina di CD16⁺ monociti collettivamente sono stati trovati per presentare TIE2 espressione e proangiogenic funzione¹⁰. Coerentemente, la stimolazione di cellule endoteliali con citochine infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale umano fattore α (TNF) o interleuchina (il-1) beta (convenzionale infiammazione) è sufficiente a far scattare la completa assunzione di CD14 classica⁺CD16 ^– monociti. Tuttavia, sono necessari per provocare la trasmigrazione del CD16 azioni simultanee di A di fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e TNFα (infiammazione guidata da fattori angiogenici)⁺ proangiogenic piscina di monociti³. Storicamente, il sistema tradizionale di Transwell in condizioni statiche, la camera di flusso di piatti paralleli e gli alloggiamenti di flusso µ-diapositiva sono stati usati per analizzare quantitativamente il reclutamento della popolazione uno leucocitaria a un tempo in vitro^{11 ,12,13}. Mentre questi protocolli sono stati convalidati, un metodo più robusto che ha permesso l’analisi simultanea di più sottopopolazioni monocito sarebbe considerato più penetrante. Tali metodologie devono rappresentano interazioni multiple e le diverse frequenze di ogni rispettiva popolazione e anche fornire una comprensione meccanicistica delle affinità e specificità per le cascate di reclutamento che definiscono ogni monocito sottoinsieme.

Qui, presentiamo un metodo basato sull’imaging time-lapse del reclutamento di monociti sotto flusso che permette le cascate migratori delle sottopopolazioni monocito diverso da studiare simultaneamente mediante microscopia confocale. Questo metodo integra alcune caratteristiche critiche che imitano l’infiammazione delle cellule endoteliali, come pure l’emodinamica di fare circolare i monociti in venule post-capillari, la sede principale del reclutamento dei leucociti in vivo. Il metodo proposto utilizza cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC), che vengono generate attraverso un protocollo ben consolidato di isolamento dal cordone ombelicale umani. Questa risorsa clinica ha il vantaggio di essere facilmente disponibile come sottoprodotto biologico, fornendo inoltre un rendimento ragionevole delle cellule endoteliali che può essere isolato dalla vena ombelicale. Abbiamo anche usato tinture fluorescenti e immunofluorescenza per distinguere tra i diversi componenti cellulari e microscopia confocale per definire inequivocabilmente monocito posizionamento (luminal vs abluminale) nel corso del tempo. Il protocollo qui presentato è stato sviluppato simultaneamente misurare i livelli di trasmigrazione delle sottopopolazioni monocito. Inoltre, si deve osservare che questa metodologia può essere esteso per studiare altre sottopopolazioni di leucociti e processi di reclutamento mediante uso di diversi biomarcatori ed etichettatura.