Summary

Étude simultanée du recrutement des sous-populations de Monocyte sous flux In Vitro

Published: November 26, 2018
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole intégré qui mesure la sous-population de monocyte traite sous flux in vitro par l’utilisation de marqueurs de surface spécifiques et la microscopie confocal fluorescence. Ce protocole peut être utilisé pour explorer les étapes séquentielles de recrutement aussi bien quant à profil autres sous-types de leucocytes à l’aide d’autres marqueurs de surface spécifiques.

Abstract

Le recrutement des monocytes du sang vers les tissus périphériques ciblés est essentiels pour le processus inflammatoire au cours de la lésion tissulaire, le développement de tumeurs et les maladies auto-immunes. Ceci est facilité grâce à un processus de capture de libre circulation sur la surface luminale de cellules endothéliales activées, suivie de leur migration transendothéliale et de l’adhérence (transmigration) dans le tissu sous-jacent affecté. Cependant, les mécanismes qui prennent en charge le recrutement préférentiel et contextuelle des sous-populations de monocytes ne sont pas encore pleinement compris. Par conséquent, nous avons développé une méthode qui permet le recrutement des sous-populations de monocyte différents en même temps visualisé et calculées sous flux. Cette méthode basée sur l’imagerie confocale Time-lapse, permettant de distinguer sans ambiguïté les monocytes adhérentes et réincarnés. Ici, nous décrivons comment cette méthode peut être utilisée pour étudier simultanément la cascade de recrutement des monocytes pro-angiogénique et non-angiogéniques in vitro. En outre, cette méthode peut être étendue afin d’étudier les différentes étapes du recrutement de trois populations de monocytes.

Introduction

Monocytes constituent une composante phagocytaire de l’immunité innée qui est essentielle pour la lutte contre les agents pathogènes, nettoyer les tissus endommagés, l’angiogenèse et la pathophysiologie de nombreuses maladies dont les cancers1,2,3 . Les monocytes sont des cellules dérivées de la moelle osseuse composées de populations hétérogènes qui circulent dans le sang, mais peuvent être recrutées sur le site de l’inflammation dans les tissus périphériques par le biais de mécanismes moléculaires spécifiques. Les cascades de recrutement des monocytes, en ce qui concerne les leucocytes en général, implique différentes étapes, y compris la capture, rouler, ramper, arrestation, la migration transendothéliale (transmigration) et migration à travers la paroi des vaisseaux (membrane basale et peinture murale 4de cellules). Ces mesures concernent principalement induite par l’inflammation des molécules sur la surface endothéliale luminale comme sélectines, ligands glycoprotéine, chimiokines, molécules d’adhésion intercellulaire et jonctionnel et leurs récepteurs sur leucocytes comme sélectine ligands et les intégrines. Voies de trafic à travers les jonctions de cellules endothéliales (paracellulaires) ou par l’intermédiaire de l’organisme de cellules endothélial (transcellulaire) peuvent être utilisés par les leucocytes de franchir la barrière endothéliale5. Tandis que les monocytes ont historiquement été documentés à transmigrer la voie transcellulaire, divergences potentielles dans leur voie migratoire ont été proposés comme monocytes ne sont plus considérés comme une population homogène de cellules. Il est maintenant évident que la diversité des monocytes peuvent être définies par chacun de leurs différences et points communs, en ce qui concerne leur extravasation distinctive cascades3,6. Par conséquent, afin de distinguer sans ambiguïté les sous-populations de monocytes, il est crucial de visualiser, et le processus de phénotype le comportement de chacun de ces différentes sous-populations lors du recrutement.

Monocytes d’être humain, porc, rat et souris ont été subdivisées en sous-populations phénotypiques avec certaines fonctions attribuées et les comportements migratoires spécifiques7,8,9. Par exemple, chez les humains, monocytes se divisent en trois sous-ensembles basés sur leur expression superficielle de CD14, un corécepteur pour lipopolysaccharide bactérien et CD16, les récepteurs Fc-gamma III. Sous-populations de monocyte humain incluent CD14 classique+CD16, les intermédiaires CD14+CD16+ et non-classique CD14dimCD16+ cellules6,9. Le CD14 classique+CD16 monocytes se sont avérées être principalement inflammatoire alors que la piscine du CD16+ monocytes trouvées collectivement de présenter TIE2 expression et on fonction10. Régulièrement, la stimulation des cellules endothéliales par des cytokines inflammatoires telles que la nécrose de tumeur humaine facteur α (TNF) ou l’interleukine (il-1) beta (inflammation conventionnelle) est suffisante pour déclencher le recrutement complet de CD14 classique+CD16 monocytes. Cependant, des actions simultanées de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) A et de TNFα (inflammation d’axée sur les facteurs angiogéniques) sont nécessaires pour provoquer la transmigration de le CD16+ on piscine de monocytes3. Historiquement, le système traditionnel de Transwell sous des conditions statiques, la chambre de flux de plaques parallèles et les chambres de débit µ-diapositive ont été utilisées pour analyser quantitativement le recrutement de la population à un moment en vitro11 un leucocyte ,12,13. Tandis que ces protocoles ont été validés, une méthode plus robuste permettant l’analyse simultanée de plusieurs sous-populations de monocyte serait considérée comme plus perspicace. Ces méthodes doivent tenir compte des interactions multiples et les différentes fréquences de chaque population respective et également fournir une interprétation mécaniste des similarités et des spécificités pour les cascades de recrutement qui définissent chaque monocyte sous-ensemble.

Nous présentons ici une méthode basée sur l’imagerie Time-lapse de recrutement de monocytes sous flux qui permet les cascades migrateurs des sous-populations de monocyte différents à étudier simultanément à l’aide de la microscopie confocale. Cette méthode intègre certaines caractéristiques essentielles qui imitent l’inflammation des cellules endothéliales, ainsi que l’hémodynamique des monocytes dans les veinules post capillaires, en circulation l’emplacement principal du recrutement des leucocytes in vivo. La méthode proposée utilise des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), qui sont générés par un protocole bien établi d’isolement du humaine de cordons ombilicaux. Cette ressource clinique a l’avantage d’être facilement disponible comme sous-produit biologique, tout en fournissant également un rendement raisonnable des cellules endothéliales qui peuvent être isolés dans la veine ombilicale. Nous avons également utilisé les colorants fluorescents et immunofluorescence d’établir une distinction entre les différents composants cellulaires et microscopie confocale de définir sans ambiguïté le monocyte positionnement (luminal vs abluminal) au fil du temps. Le protocole présenté ici a été développé pour mesurer simultanément les niveaux de la transmigration des sous-populations de monocytes. En outre, il convient de noter que cette méthode peut être étendue afin d’étudier les autres sous-populations de leucocytes et le processus de recrutement par l’utilisation de différents biomarqueurs et l’étiquetage.

Protocol

Matériel humain ont été utilisés avec le consentement éclairé des donneurs volontaires et conformément à la Suisse les comités d’éthique sur la recherche clinique. 1. isolement et gel des ombilical humain de la veine des cellules endothéliales (HUVEC) Ajouter 5 mL de solution d’enrobage dans une fiole de T75 (0,1 mg/mL collagène G et 0,2 % de gélatine dans du PBS solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,4) pendant 30 min à 37 ° C avant de lancer l’isolemen…

Representative Results

Détermination de l’état d’activation de HUVEC induite par le TNFα La bio-activité de la cytokine inflammatoire TNFα peut être varier selon le lot et la réplétion du cycle gel-dégel. Il est important de vérifier l’état d’activation des HUVEC avec traitement de TNFα. Cela pourrait être interprété par coloration en parallèle quelques échantillons de HUVEC confluente pour l’induction inflammatoire des sélect…

Discussion

Nous rapportons ici une méthode décrivant une étude de comment les sous-populations de monocyte transmigrer par le biais de la monocouche endothéliale enflammée. La méthode discutée utilisé la microscopie confocale au lieu de la microscopie à contraste de phase, qui est également utilisée pour étudier le recrutement des monocytes sous flux3,11,19. Un des principaux avantages de l’utilisation de la microscopie confo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Paul Bradfield pour lecture de manuscrit et des rétroactions. A. S. a reçu un soutien financier de la Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust Reg.,

Materials

Tissue Culture Flasks 75 cm2 TPP 90076 Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4 IBIDI 80606
Centrifuge Tubes 15 mL TPP 191015
Centrifuge Tubes 50 mL TPP 191050
Collagen G Biochrom L 7213 For coating of cell culture flasks
Gelatin Sigma-Aldrich 1393 For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
3-Way Stopcocks BIO-RAD 7328103
penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml AMIMED 4-02F00-H
Collagenase type 1 Worthington LS004216
Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes GIBCO 22340020
Bovine Albumin Fraction V ThermoFisher 15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg Millipore 02-102
Heparin Sodium Sigma-Aldrich H3149RT
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H6909
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O APPLICHEM A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC Miltenyi Biotech 130-100-713 AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE Miltenyi Biotech 130-110-807 AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC Miltenyi Biotech 130-107-016 AB_2653263
BD Accuri C6 Plus BD Bioscience
µ-Slide I Luer IBIDI 80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) ThermoFisher C2925
Recombinant human TNFα Peprotech 300-01A
Recombinant human VEGFA Peprotech 100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump KF Technology NE-1000
Ficoll Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE Miltenyi Biotech 130-110-519 AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human Miltenyi Biotech 130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE Miltenyi Biotech 130-106-762 AB_2655403
LS columns Miltenyi Biotech 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech 130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate ThermoFisher H1399
Silicone tubing IBIDI 10841
Elbow Luer Connector IBIDI 10802
Female Luer Lock Coupler IBIDI 10823
Luer Lock Connector Female IBIDI 10825
In-line Luer Injection Port IBIDI 10820
Ar1 confocal microscope Nikon
40X objective Nikon 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software NIH

References

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Cite This Article
Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes, T., Wehrle-Haller, B., Sidibé, A. Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58509, doi:10.3791/58509 (2018).

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