Summary

מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה

Published: November 26, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול משולב המודד מונוציט subpopulation סחר תחת זרימה במבחנה באמצעות סמני פני שטח מסוים, מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את השלבים רציפים גיוס גם לגבי פרופיל אחרים יחוברו ליקוציט באמצעות סמנים אחרים משטח מסוים.

Abstract

הגיוס של monocytes מהדם לרקמות היקפיים יישוב הינה קריטית תהליך דלקתי במהלך פגיעה ברקמות, התפתחות גידולים ומחלות אוטואימוניות. זה נהיה בתהליך של לכידת זרימה חופשית על גבי המשטח luminal של תאי אנדותל מופעל, ואחריו להגירתם אדהזיה ו- transendothelial (גלגול) לתוך הרקמה הבסיסית המושפעת. עם זאת, המנגנון תומכים בגיוס מועדף, תלויי-ההקשר מונוציט subpopulations עדיין לא לגמרי מובנים. לכן, פיתחנו שיטה המאפשרת הגיוס של subpopulations מונוציט שונים בו זמנית מדמיין, שנמדד תחת זרימה. שיטה זו, המבוססת על הדמיה קונאפוקלית זמן לשגות, מאפשר ההבחנה ברורה וחד משמעית בין חסיד, שמדמו ומונוציטים. כאן, אנו נתאר כיצד ניתן להשתמש בשיטה זו ללמוד בו זמנית את המפל גיוס של pro-אנגיוגנזה, הלא-אנגיוגנזה ומונוציטים במבחנה. יתר על כן, שיטה זו ניתן להרחיב ללמוד את שלבי הגיוס של עד שלוש אוכלוסיות מונוציט שונים.

Introduction

ומונוציטים מהווים מרכיב phagocytic של מולדת חסינות זה חיוני בלחימה פתוגנים, מנקה את רקמות שנפגעו אנגיוגנזה, הפתופיזיולוגיה של מחלות רבות, כולל סרטן1,2,3 . ומונוציטים הם תאים הנגזרות מח העצם מורכב subpopulations הטרוגנית במחזור הדם, אבל יכול להיות גויסו לאתר של דלקת ברקמות היקפיים באמצעות מנגנונים מולקולריים ספציפיים. למפל גיוס של monocytes, באשר לויקוציטים מרמז באופן כללי, שלבים שונים כולל לכידת, גלגול, זחילה, מעצר, transendothelial ההעברה (גלגול) העברה דרך הקיר כלי (קרום המרתף, ציור קיר תאים)4. שלבים אלה כוללות בעיקר דלקת-induced מולקולות על פני אנדותל luminal כגון selectins, ליגנדים גליקופרוטאין, נוגדנים, מולקולות אדהזיה המערכת, מהחיבור שלהם רצפטורים על לויקוציטים כגון בחירת שמלות ליגנדים אינטגרינים. סחר מסלולים דרך גם את תאי אנדותל צמתים (paracellular) או דרך הגוף תא אנדותל (transcellular) ניתן על ידי לויקוציטים לחצות את המכשול אנדותל5. בעוד ומונוציטים היסטורית תועדו כדי transmigrate דרך המסלול transcellular, פערים פוטנציאליים במסלול הנדידה שלהם הוצעו כפי ומונוציטים כבר לא נחשבים אוכלוסיה הומוגנית התא. עכשיו כעת ברור כי גיוון מונוציט יכולה להיות מוגדרת על ידי כל אחד של ההבדלים שלהם מכנה משותף, ביחס extravasation הייחודי שלהם מפלי3,6. לכן, על מנת חד משמעית מתלבטים מונוציט subpopulations, זה חיוני כדי להמחיש ולעבד פנוטיפ ההתנהגות של כל אלה subpopulations שונים במהלך הגיוס.

ומונוציטים מן האדם, חזיר, החולדה, העכבר היו המתפרשות לתוך subpopulations פנוטיפי עם פונקציות ייחסה של התנהגויות ספציפיות נודדות-7,8,9מסוימים. לדוגמה, בבני אדם, ומונוציטים ניתן לחלק שלוש קבוצות משנה המבוסס על שלהם ביטוי פני השטח של CD14, coreceptor עבור ליפופוליסכריד חיידקי, CD16, הקולטן Fc-גמא השלישי. מונוציט האנושי subpopulations כוללים CD14 קלאסית+CD16, ביניים CD14+CD16+ וקלאסי CD14עמוםCD16+ תאים6,9. CD14 הקלאסית+CD16 ומונוציטים הוכחו להיות בעיקר דלקתיות ואילו הבריכה של CD16+ ומונוציטים נמצאו באופן קולקטיבי להציג TIE2 proangiogenic וביטוי פונקציה10. באופן עקבי, תאי אנדותל גירוי עם ציטוקינים דלקתיים כגון גידול אנושי נמק פקטור (TNF) α או אינטרלוקין (IL-1) בטא (דלקת קונבנציונלי) מספיקה לעורר גיוס מלא של קלאסית CD14+CD16 ומונוציטים. לעומת זאת, נדרשות פעולות בו-זמניות של כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) A ו TNFα (דלקת מונחה גורמי אנגיוגנזה) לעורר גלגול של CD16+ proangiogenic בריכה של monocytes3. מבחינה היסטורית, שימשו את המערכת Transwell המסורתית תחת תנאים סטטיים תא זרימה לוחית מקבילים, התאים זרימה ממוצע שקופית לנתח באופן כמותי את גיוס ליקוציט אחד האוכלוסייה בגיל זמן במבחנה11 12, ,13. בעוד יש פרוטוקולים אלה מאומתים, שיטה עמידים יותר כי מותר ניתוח בו זמנית של מספר מונוציט subpopulations ייחשב נבונה יותר. מתודולוגיות כזה חייב חשבון עבור אינטראקציות מרובות, התדרים שונות של כל האוכלוסייה בהתאמה ולספק גם הבנה מכניסטית של דמיון ושל specificities למפל גיוס המגדירים כל מונוציט משנה.

כאן, אנו מציגים שיטה המבוססת על ההדמיה בצילום מואץ של הגיוס מונוציט תחת זרימה אשר מאפשר את מפלי נודדות מונוציט שונים subpopulations שילמדו בו זמנית על-ידי שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו משלבת תכונות מסוימות קריטיות לחקות דלקת תא אנדותל, כמו גם את ספיקת הדם של מחזורי ומונוציטים ב venules נימי פוסט, המיקום המרכזי של גיוס ליקוציט ויוו. השיטה המוצעת משתמשת יפתור אנדותל תאים (HUVEC), אשר נוצרות באמצעות פרוטוקול ומבוססת של בידוד מן האדם חוטי חבל הטבור. משאב קליני זה יש את היתרון של להיות זמין בקלות היא מוצר לוואי ביולוגיות, בעוד גם מתן תשואה סבירה של תאי אנדותל שניתן שבודד וריד הטבור. השתמשנו גם צבעי פלורסנט, immunofluorescence להבחין בין מרכיבי התא השונים, מיקרוסקופיה קונפוקלית חד משמעית להגדיר מונוציט מיצוב (luminal לעומת abluminal) לאורך זמן. פרוטוקול המובאת כאן פותחה כדי למדוד בו זמנית את רמות גלגול מונוציט subpopulations. יתר על כן, יש לציין כי מתודולוגיה זו ניתן להרחיב את לימוד אחרים לויקוציטים subpopulations, תהליכי גיוס על ידי שימוש סמנים ביולוגיים שונים וסימון.

Protocol

חומרים אנושיים שימשו עם הסכמה מדעת של התורמים המתנדבים ועל פי ועדות האתיקה השוויצרי על מחקר קליני. 1. בידוד וקופא של חבל הטבור האנושי הווריד תאי אנדותל (HUVEC) הוסף 5 מ של ציפוי פתרון בקבוקון T75 (0.1 מ”ג/מ”ל קולגן G ו- 0.2% ג’לטין ב- PBS מלוחים פוספט באגירה מלאה ב- pH 7.4) במשך 30 דקות ב 37 מ…

Representative Results

קביעת מצב הפעלה HUVEC שנגזרות TNFα הביו-פעילות ציטוקינים דלקתיים TNFα יכול להשתנות לפי את אצוות גודש של מחזור מפשיר לקפוא. חשוב לבדוק את מצב ההפעלה של HUVEC עם טיפול TNFα. זה יכול להתבצע על ידי צביעת במקביל דוגמאות HUVEC confluent עבור אינדוקציה דלקתיות של s…

Discussion

כאן, אנו מדווחים על שיטה המפרט מחקר של מה מונוציט subpopulations transmigrate דרך טפט אנדותל מודלק. השיטה דנו להשתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית במקום שלב-ניגודיות מיקרוסקופ, אשר משמש גם ללמוד מונוציט גיוס תחת זרימה3,11,19. אחד היתרונות של שימוש מיקרוסקופיה ק?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ד ר פול Bradfield על כתב היד הקריאה ואת המשוב. א ס קיבלו תמיכה כספית מארגון אדוני ג’ולס ת’ורן צדקה בחו ל לבטוח רג,

Materials

Tissue Culture Flasks 75 cm2 TPP 90076 Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4 IBIDI 80606
Centrifuge Tubes 15 mL TPP 191015
Centrifuge Tubes 50 mL TPP 191050
Collagen G Biochrom L 7213 For coating of cell culture flasks
Gelatin Sigma-Aldrich 1393 For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
3-Way Stopcocks BIO-RAD 7328103
penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml AMIMED 4-02F00-H
Collagenase type 1 Worthington LS004216
Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes GIBCO 22340020
Bovine Albumin Fraction V ThermoFisher 15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg Millipore 02-102
Heparin Sodium Sigma-Aldrich H3149RT
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H6909
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O APPLICHEM A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC Miltenyi Biotech 130-100-713 AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE Miltenyi Biotech 130-110-807 AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC Miltenyi Biotech 130-107-016 AB_2653263
BD Accuri C6 Plus BD Bioscience
µ-Slide I Luer IBIDI 80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) ThermoFisher C2925
Recombinant human TNFα Peprotech 300-01A
Recombinant human VEGFA Peprotech 100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump KF Technology NE-1000
Ficoll Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE Miltenyi Biotech 130-110-519 AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human Miltenyi Biotech 130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE Miltenyi Biotech 130-106-762 AB_2655403
LS columns Miltenyi Biotech 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech 130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate ThermoFisher H1399
Silicone tubing IBIDI 10841
Elbow Luer Connector IBIDI 10802
Female Luer Lock Coupler IBIDI 10823
Luer Lock Connector Female IBIDI 10825
In-line Luer Injection Port IBIDI 10820
Ar1 confocal microscope Nikon
40X objective Nikon 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software NIH

References

  1. Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).
  2. De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).
  3. Sidibe, A., et al. Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours. Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).
  4. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  5. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  6. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).
  7. Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).
  8. Chamorro, S., et al. In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).
  9. Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74 (7), (1989).
  10. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  11. Bradfield, P. F., et al. JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation. Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).
  12. Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation. Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).
  13. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha. Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).
  14. ibidi GmbH. . Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides – Based on Numerical Calculations. , (2014).
  15. Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
  16. Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression. Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).
  17. Wong, D., Dorovini-Zis, K. Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).
  18. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  19. Bradfield, P. F., et al. Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques. PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).

Play Video

Cite This Article
Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes, T., Wehrle-Haller, B., Sidibé, A. Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58509, doi:10.3791/58509 (2018).

View Video