Summary

O corte e o método flutuante para tecido parafina para seccionamento

Published: September 05, 2018
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar o corte de parafina. Este método combina flutuante usando uma simples câmara termostática para evitar o processo de transferência exigido pelo método convencional e de corte. Como resultado, a eficiência e o número de cortes de parafina intactas foram grandemente melhoradas.

Abstract

Corte do tecido parafina é amplamente utilizado em histologia e patologia. No entanto, é tedioso. Para melhorar este método, várias empresas comerciais criaram sistemas de transferência de seção complexo usando água fluida. Para simplificar essa tecnologia, criamos um método simples usando equipamento caseiro que combina o corte e flutuando dentro de uma câmara termostática simples; Portanto, as seções entram automaticamente o banho de água na superfície da água. O hipocampo do cérebro do rato adulto, rato adulto rins, cérebro de rato embrionárias e olhos adultos do zebrafish foram cortadas usando parafina convencional de corte e o método apresentado para comparação. Análise estatística mostra que nosso método melhorado poupado tempo e produziu seções de qualidade superiores. Além disso, parafina seccionamento de um espécime em um curto período de tempo é fácil para os operadores Júnior.

Introduction

Estudo morfológico é importante na pesquisa biológica. Apesar de nova tecnologia permitiu que os pesquisadores a observar seus alvos diretamente do tecido inteiro ou organismos1,2,3, cortar a amostra em seções finas, seguiram de coloração, continua a ser o principal morfologia de tecido único método porque mas também proteína alvo diretamente no tecido. Microscopia de luz usa três tipos de seção: parafina, congelada e semithin. Embora cryosectioning é comum para proteger antigenicidade de tecido, e a preparação das amostras é simples, a morfologia do tecido retido é pobre e inadequado para fino corte4,5. Corte de parafina é o método mais frequentemente usado para exibindo morfologia bem preservada. Como os espécimes são desidratados completamente e incorporados em cera, os blocos de parafina podem ser armazenados indefinidamente. Além disso, parafina seccionamento produz seções finas que melhorar o acesso da sonda biológica em novas experiências e reduzem a sobreposição de camadas de célula na direção Z.

No entanto, seccionamento de parafina convencional é tedioso e exige habilidade do operador. Cortes de parafina passam por fixação, desidratação, incorporação, cortando e flutuante. Importante, transferir fitas seção do suporte da faca para o banho de água é necessária mas difícil para os operadores Júnior. Especialmente no ar seco, as fitas da seção torce-se devido à eletricidade estática em são difíceis de se desdobrar na superfície de água morna. Para melhorar a seção qualidade, umedecendo a superfície do tecido exposto entre passes de lâmina micrótomo, refrigerando os blocos de cera por imergindo-os em água gelada, ou levantando a umidade com um umidificador perto do micrótomo é recomendada6,7 . Novos métodos para melhorar a parafina seccionamento incluem híbrido parafina incorporação cryosectioning8e setor comercial transferência sistema assistência9. Embora esses métodos parcialmente melhorar parafina seccionamento velocidade e qualidade, eles fazem o corte muito mais pesado, e sistemas de transferência de seção comercial são caros.

Neste protocolo, demonstramos como criar equipamentos simples, barato e flexível passo a passo, que podem ser conectado à porta de um micrótomo rotativo. Este equipamento é composto de um canal de seção, um banho de água e um aquecedor com um interruptor de deteção de temperatura. Após o corte, dezenas de seções fluem para o canal de seção e insira o banho de água diretamente, assim se desenrola automaticamente. Isto melhora a eficiência de corte de parafina e faz com que esta tecnologia mais conveniente. Usando este método, mais adultas seções hippocampal do rato, seções de rim de rato adulto, embrionárias 15,5 dias de idade (E15.5) do mouse cérebro seções e olho adulto zebrafish seções foram colhidas em menos tempo e manteve-se intacta mais morfologicamente. Esse método também pode ser usado para outras amostras de tecidos que requerem parafina acelerada de corte, evitando a perda de distinção da seção.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso de Universidade de Nanchang e cuidado Animal. 1. montar o equipamento e conectar o micrótomo Desenha o parâmetro pelos requisitos (Supplementary Figura 1). Submeta o parâmetro para uma fábrica local para fabricar as placas de acrílico. Montar todas as peças na sequência: usar clorofórmio para combinar 7 placas de acrílico comerciais em um ta…

Representative Results

O método melhorado aumentou o número de cortes de parafina intacta. Nós testamos este novo método no tecido hippocampal do rato adulto, rato adulto rins, cérebro de rato embrionárias e olhos do zebrafish. Água foi adicionada ao tanque, e a temperatura da água foi mantida entre 38,0 ° C e 40,0 ° C. Depois de uma série preparar as amostras de tecido, foram seccionados e comparados com corte convencional. O novo método de evitar a perda de seção e aumentou a proporção de seç…

Discussion

Para melhorar a morfologia de seção de parafina e resolver o problema do desperdício de tempo durante o corte de parafina convencional, criamos uma parafina melhorada método que combina o corte e o desdobramento de seccionamento. Este método de melhoria se baseia em equipamento simples que compreende um canal de seção, um banho de água e um aquecedor com um interruptor de deteção de temperatura. A faixa de opções da seção entra o banho de água através do canal de seção e desenrola-se automaticamente dur…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 31400936, 31460260) e a ciência Natural Fundação de Jiangxi província da China (20171BAB215020). Agradecemos também o programa conjunto entre a Universidade de Nanchang e Queen Mary University of London para apoiar este trabalho.

Materials

Incubator Boekel Scientific 133000-2
Ethanol  Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid 64-17-5
Xylene  Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid 1330-20-7
Paraplast Leica 39601006
Heated Paraffin Embedding Module Leica
Commercial acrylic board
Trichloromethane Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid 67-66-3
Tubular electric heating element(12V 200W)
Temperature controller(12v 120w) Mingsuo XH-W3002
Rotary microtome  Leica
Neutral silicone sealant Link the water channel with the microtome knife holder
Voltage transformer Dearll S-250-12
Disposable blade Accu-Edge 4689
Hematoxylin Baso Diagnostics Inc. BA-4025
Eosin  Baso Diagnostics Inc. BA-4025
Microslide Sail Brand 7105
Neutral balsam Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid 10004160
Coverslip  Citoglas 10212424C
Microscope Carl Zeiss
Hydrochloric acid Xilong Chemical 7647-01-0
Water bath for paraffin sections Leica
HistoCore Arcadia C - Cold Plate Leica
paraffin repellent spray  Thermo Scientific 9990420

References

  1. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  2. Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
  3. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
  4. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).
  5. Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
  6. Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
  7. Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
  8. Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).
  9. Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).
  10. Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
  11. Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
  12. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
  13. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).
  14. Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
  15. Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).

Play Video

Cite This Article
Qin, C., Bai, Y., Zeng, Z., Wang, L., Luo, Z., Wang, S., Zou, S. The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning. J. Vis. Exp. (139), e58288, doi:10.3791/58288 (2018).

View Video