Summary

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Published: March 29, 2018
doi:

Summary

Bu çalışmada tersinir doku takas, immunostaining, 3D işleme ve analiz insan plasenta villus örneklerinde sırasına 1-2 mm3damar ağları için bir protokol sunar.

Abstract

Anne intervillous kan ve insan plasenta parankimi çoğunu yapar büyük villous kılcal ağ arabiriminin, anne ve fetüs arasındaki besin ve gaz değişimi gerçekleşir. Distal villous kılcal damarları dışarı–dan göbek kordonu uzanan dallanma birkaç kuşak sonra fetal kan akımı terminus ağıdır. Bu ağ bir bitişik hücresel kılıf, fetal kan karıştırma engeller sinsisyal Trofoblast bariyer tabakası ve içinde sürekli boğulmuş olduğunu maternal kan var. Maternal diyabet, hipertansiyon ve obezite, gibi bozukluklar meydana plasental kılcal ağ bütünlüğü için hakaret fetus, çocuk ve yetişkin için bu mevcut ciddi sağlık riskleri doğurabilir. Bu hakaret yapısal etkileri daha iyi tanımlamak için bir protokol kılcal ağ yapısı onda bir topolojik özellikleri tam karmaşıklığı içinde araştırmak için 1-2 mm3 sırasına yakalar Bu çalışma için geliştirilmiştir. Terminal villus kümeleri plasenta üzerinden bunu yapmak için disseke ve Trofoblast katman ve kapiller endothelia immunolabeled vardır. Bu örnekler o zaman confocal görüntü yığınları z-~ 1 mm derinliklerinde elde etmek olanaklı kılan süreci temizleyerek yeni bir doku ile açıklık. Bu yığınlar üç boyutlu render sonra işlenir ve bu yaklaşım için uygunluğunun doğrulanmasını birim, kılcal damar dalları ve kapiller şube bitiş noktaları, sayısı gibi temel kapiller ağ tedbirler oluşturmak için analiz kapiller ağ karakterizasyonu.

Introduction

Gelişen plasenta ve onun patolojiler anlayışımızı büyük ölçüde bitişik villus ve histolojik kesitler elde bulunan kılcal damarlar arasındaki uzamsal ilişkileri anlaşılmaktadır için sınırlı. Bu çalışmada, biz üç boyutlu (3D) kaplamalar kılcal ağ özellikleri (dallanma, Kesintisizlikörneğin ) analizleri için uygun insan plasental kılcal damar ağları oluşturmak için bir araç geliştirerek bu sorunu ele sahip. Bunu yapmak için iki ticari doku Temizleme ürünleri, Visikol-1 ve Visikol-2 (aşağıda çözüm-1 ve çözüm-2 anılacaktır) ile immünfloresan boyama birleştirdik.

İnsan plasenta kan damarlarının anne intervillous kan ve gelişmekte olan fetus arasında arayüz bulunan büyük bir kompleks olduğunu. Dışarı onun ekleme koryonik plaka içine uzanan, göbek kordonu atar ve toplar damarlardaki ayrıntılı damar ağıyla koryonik yüzey kapsayacak şekilde ramify bir ağ içine dalları. Amaçları sonra aşağı iç ya da nerede birçok daha dallanma nesiller geçmesi ve bitir, terminal villus ve içerdiği kapiller ağlarına gazlar, besin, Satım sitesi plasental disk derinliği içine nüfuz ve metabolik Fetal-maternal kan kaybı.

Plasental kapiller ağ geliştirme sırasında hakaret fetus, yeni doğan bebek ve acil yetişkin 1,2,3sağlığı için kalıcı sonuçlar doğurabilir. İçinde görüş-in gebelik ile ilgili patolojiler düşük, intrauterin büyüme kısıtlama, gibi ön eklampsi ve maternal diyabet 4,5,6 orada ölçüm yöntemleri geliştirmek üzerine yerleştirilen bir yüksek değerdir ve plasental villous kılcal damar ağları karakterizasyonu. Büyük bir barikat plasental damar ağları geniş ölçekli bir kapsayacak var. Yüzey damar ağları olarak 4-5 mm çapında büyük olabilir. Terminal villous kılcal damar çapı 10 -20 µm sırasına vardır; Plasenta kan damarlarının 7300 km üzerinde içerir. Şu anda, bu büyük gemi ölçek-ebilmek esir alma birkaç kolay ve hızlı teknikleri vardır. Bugüne kadar az sayıda villus mikroskobu tarafından işlenebilir. Örneğin, Jirkovska ve ark. plasental villus dönem confocal mikroskobu 120 µm kalınlığında bölümlerden elde edilen 1 µm aralıklarla seri optik bölümleri birleştirme duruldu; veri yokken okudu örnekleri ne de istatistik sayısı 8temin edilmiştir. Kılcal damar yapıları tespit edilmiştir ve çizilmiş, görüntü analizi için ihraç tracings ile kontür villus ve kılcal damarlar. Yazarlar ve bulguların “büyüyen villous damar ağı için” etkileri komisyonda görüşürken, zaman sadece “terimi” (36 + hafta gebelik yaşı) doku eğitimi böyle sonuçlara sorunlu. Benzer şekilde, Mayo et birl. ve Pearce ve ark. dayanıyordu kan akışı ve oksijen transferi, onların simülasyonları için aynı yaşta dokular ama onların analizleri sadece birkaç terim, terminal villus 9,10 sınırlı idi . Stereology da villous damarlarının yapısını çalışma odasına uygulanmıştır. Ama yine, odak genellikle daha sonraki gebelikler ile bir veya daha fazla gebelik komplikasyonları 11,12liveborn bebekler teslim olmuştur.

Yakın zamana kadar confocal mikroskobu emme uyarma ve floresan emisyon nedeniyle örten doku 13 tarafından 100-200 µm derinliklerinde doku görüntüleme sınırlıydı. Geri dönüşümsüz hiperhidrasyon aracılığıyla hücresel Morfoloji zarar olsa takas doku ve 3D Histoloji yaygın olarak literatürde tarif edilmiştir ve orada birçok takas doku için çok sayıda yöntem genel olarak, dokular ile kullanım için uygun olmayan proteinler veya lipidler kaldırılması. Bu nedenle, bu sonuçlar doku kendisi ve temizleme işlemi bizim doku karşı geleneksel Histoloji doğrulayamıyor tersinir bir tekniktir, ancak işleme gelen eserler göstergesi olduğunu doğrulamak mümkün değil. Doku takas genellikle üç ana yaklaşımdan birini içerir: 1) nedeniyle sürekli mercek neden toplu ışık saçılma kaldıran batma RI eşleşen çözümlerinde tarafından Tekdüzen kırılma indisini (RI) doku bileşenlerinin eşleştirme dalgalanma düşük RI (sitozol) ve yüksek RI (protein/lipidler) bileşenlerinin; 2) hidrojel gömme ve lipid bileşenleri kaldırmak için Elektroforez/Difüzyon kullanmak yoluyla lipid bileşenleri kaldırma; 3) artan penetrasyon çözücüler RI 13tekdüzelik teşvik etmek için izin vermek için protein yapısının genişleme/denatürasyon. Bu yaklaşımlar doku şeffaf render ve biyolojik 3D temsilleri için oluşturulmasına izin ver, bu görüntüleri doku özelliklerini gösterge olup olmadığını belirlemek zor olduğu gibi bu 3D temsilcilikleri şüpheli klinik değeri iken veya takas işlemi doku. Bizim doku takas geri dönüşümlü olduğundan Öte yandan, standart histolojik ve/veya immünhistokimya değişiklikler klinik olarak anlamlı olup aynı doku uygulanabilir.

Bu çalışmada bir analiz toplam 23 klinik olarak normal ve electively sonlanmış gebeliklerin 9-23 tamamlanan haftalık gebelik ve iki tam dönemlik normal teslimatlar arasında elde edilen 47 distal villous örnekleri sunar. Ayirt etiketleme Trofoblast ve endothelia villous damar ağları ve onların karmaşıklığı değişiklikler bir nicel ve otomatik analiz sağladı.

Bu protokol ile izole ve terminal villus ve kapiller ağlarına mümkün değil bir ölçekte daha önce analiz etti. Villous ve kapiller ağ geliştirme için gebelik uygulandığında bu yaklaşım sağlıklı bir çocuk doğum için temelidir bu özellikleri tanımlar. Karmaşık gebelik çalışmaları için uygulandığında, Ayrıca zaman ve plasental patolojileri villous ağaçlar ve onlar kılıf kılcal damar ağları değiştirmek ve bunlar fetal iyilik üzerinde vurmak nasıl açıklığa kavuşacaktır.

Protocol

Bu protokol kuralları New York Devlet Enstitüsü temel araştırma için gelişimsel Engelli insan araştırma Etik Komitesi izler. 1. villous ağacı diseksiyon Plasenta doku formalin kaldırıp bir kabında diseksiyon mikroskop sahnesinde yerini için buffed fosfat serum fizyolojik (PBS)14 ile sabit formalin durulayın. Neşter ve forseps iyi villous ağaçlar (beyaz ipliksi dallanma yapıları) bulmak için plasenta doku ayrı alay için kullanın. İ. a?…

Representative Results

İnsan 8 hafta gebelik yaşı vadeli teslim için plasenta içinde terminal villus kümeler halinde kılcal oluşturulan 3D render bireysel kümeleri sayılır ve ağ analizi için Iskeletlenmiş. Fonksiyonel plasenta (şekil 1A) yüzey gemileri nerede onlar plasenta parankimi (şekil 1Bve genişlemiş içinde 1 C) nüfuz bir uzantısı olan villus ağaçlar birimleridir. Bir dis…

Discussion

Kurumsal değerlendirme Komitesi electively sonlanmış gebeliklerin üzerinden formalin fiksasyon için plasenta villous doku topluluğu onayladı. Yordamlar gerçekleştirilmesi için önce tıbbi kayıt kısa bir tekrarıdır maternal yaş, eşlik, kaydetti ve herhangi bir (örneğin, hipertansiyon, şeker hastalığı ve lupus) altta yatan tıbbi ya da cenin (yapısal veya Kromozom anomalileri, yokluğu doğruladı anormal büyüme) gerçekleştirildi. Veri sayfası ve herhangi bir toplanan numuneler sadece …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser gelişme bozuklukları ve plasental Analytics LLC, New Rochelle, NY olan kişiler için New York eyalet Office tarafından desteklenmiştir.

Materials

10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer Macron Fine Chemicals H-121-08 General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic
Scalpel blades ThermoFisher Scientific 08-916-5B No. 11
Scalpel ThermoFisher Scientific 08-913-5
Fine forceps Electron Microscopy Services 78354-119
Micro Tube (1.7 mL) PGC Scientifics 505-201
Phosphate buffered saline Sigma D8537 PBS
Pipette VWR 52947-948 disposable, 3ml transfer pipette
Triton X-100 Boehriner Mannheim 789 704 Dilute to 0.1% from stock
Goat Serum Gibco 16210-064 Dilute to 2% in PBS solution
Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) ThermoFisher Scientific MS-1352-RQ
Rabbit Anti-CD31 antibody Abcam ab28364
green emitting (520 nm) fluorochrome  Invitrogen A11017 Alexa-Fluor 488
infrared emitting (652 nm) fluorochrome Invitrogen A21072 Alexa Fluor 633
Ethanol alcohol 200 proof Pharmco-Aaper 111000200 Dilute down to lower concentrations using PBS as needed
Solution-1 Visikol Inc. Visikol Histo-1
Solution-2 Visikol Inc. Visikol Histo-2
Skyes-Moore chambers BellCo Glass Inc. P/N 1943-11111
25 gauge needle ThermoFisher Scientific 14-826AA BD Precision Glide Needes
3 mL syringe ThermoFisher Scientific 14-823-40 BD disposable syringe
PDMS silicon sheets McMaster-Carr P/N 578T31
confocal microscope Nikon Inc. Nikon C1 Confocal Microscope
Deconvolution software Media Cybernetics AutoQuant X22
Fiji image processing software free, Open source  software available at https://fiji.sc
Hematoxylin Leica Biosystems 3801570 Component 1 of SelecTech H&E staining system
Alcoholic Eosin Leica Biosystems 3801615 Component 2 of SelecTech H&E staining system
Blue Buffer Leica Biosystems 3802918 Component 3 of SelecTech H&E staining system
Aqua Define MCX Leica Biosystems 3803598 Component 4 of SelecTech H&E staining system
Immunohistochemistry detection system ThermoFisher Scientific TL-125-QHD UltraVision Quanto Detection System HRP DAB

References

  1. Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, 47-53 (2016).
  2. Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
  3. Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
  4. Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
  5. Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
  6. Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
  7. Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
  8. Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
  9. Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
  10. Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
  11. Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
  12. Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
  15. Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
  16. Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).

Play Video

Cite This Article
Merz, G., Schwenk, V., Shah, R., Salafia, C., Necaise, P., Joyce, M., Villani, T., Johnson, M., Crider, N. Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks. J. Vis. Exp. (133), e57099, doi:10.3791/57099 (2018).

View Video