Summary

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Published: March 29, 2018
doi:

Summary

Diese Studie stellt ein Protokoll für die reversible Gewebe, clearing, Immunostaining, 3D-Darstellung und Analyse von vaskulären Netzwerken im menschlichen Plazenta Zotten Proben in der Größenordnung von 1 bis 2 mm3.

Abstract

Nährstoff- und Gas-Austausch zwischen Mutter und Fötus erfolgt an der Schnittstelle von der mütterlichen intervillous Blut und die riesigen Zotten engmaschiges Netz, aus denen sich ein Großteil der Parenchym der menschlichen Plazenta. Die distale Zotten Kapillarnetzes ist die Endstation der fetalen Blut-Versorgungsmaterial nach einigen Generationen der Verzweigung von Schiffen aus der Nabelschnur. Dieses Netzwerk hat einen zusammenhängenden zellulären Mantel, syncytial Trophoblast Sperrschicht, die verhindert, dass der fetalen Blut mischen und dem mütterlichen Blut in dem es ständig gebadet wird. Beleidigungen, die Integrität der plazentaren Kapillarnetzes auftretenden Störungen wie mütterlicher Diabetes, Bluthochdruck und Übergewicht, haben Konsequenzen dieser vorliegenden schwerwiegende gesundheitliche Risiken für den Fötus, Säugling und Erwachsenen. Um die strukturellen Auswirkungen diese Beleidigungen besser zu definieren, entwickelte ein Protokoll für diese Studie, die Kapillarnetzes Struktur in der Größenordnung von 1 bis 2 mm3 erfasst, wobei man seine topologischen Eigenschaften in ihrer ganzen Komplexität untersuchen kann. Um dies zu erreichen, werden Cluster von terminal Zotten aus Plazenta seziert und der Trophoblast-Schicht und die Kapillaren Gefäßendothelien sind Immunolabeled. Diese Proben werden dann geklärt, mit einem neuen Tuch clearing-Prozess, der es ermöglicht, konfokale Bild Stapeln bis Z-Tiefe von ~ 1 mm erwerben. Die dreidimensionale Darstellungen von diesen Stapeln dann verarbeitet und analysiert, um grundlegende Kapillarnetzes Maßnahmen wie Volumen, Anzahl der Kapillare Niederlassungen und Kapillare Verzweigungspunkte zu Ende, als Bestätigung der Eignung dieses Ansatzes für generieren engmaschiges Netz Charakterisierung.

Introduction

Unser Verständnis von der entwickelnden Plazenta und seine Krankheiten ist in hohem Maße begrenzt, räumliche Beziehungen zwischen benachbarten Zotten und enthaltenen Kapillaren histologischen Abschnitten abgeleitet abgeleitet. In dieser Studie haben wir dieses Problem angesprochen, durch die Entwicklung der Mittel, um dreidimensionale (3D) Darstellungen der menschlichen Plazenta Kapillare Netzwerke zu generieren, die für Analysen der Kapillare Netzwerk-Features (z. B. Verzweigungen, Festigkeit) geeignet sind. Zu diesem Zweck haben wir zusammengefasst, immunofluorescent Färbung mit zwei kommerzielle Gewebe Clearing-Produkte, Visikol-1 und Visikol-2 (im folgenden genannt als Lösung 1 und Lösung 2).

Die menschliche Plazenta ist einen riesigen Komplex von Blutgefäßen befindet sich an der Schnittstelle zwischen intervillous Blut der Mutter und den sich entwickelnden Fötus. Heraus aus ihrer Einfügung in die Chorion Platte erstreckt, verzweigt sich die Nabelschnur in ein Netz von Arterien und Venen, die zur Deckung die Chorion Oberfläche mit einem aufwendigen vaskuläre Netzwerk ramify. Ihre Enden dann nach unten in den innen- oder Tiefe der plazentaren Scheibe wo sie mehrere Generationen mehr Verzweigungen zu unterziehen und am Ende in die Klemme Zotten und ihre enthaltenen Kapillare Netzwerke, die Website für den Austausch von Gasen, Nährstoffe, eindringen und Stoffwechselerkrankungen Abfall zwischen fetalen und mütterlichen Blut.

Beleidigungen, die Plazenta Kapillarnetzes während der Entwicklung haben langfristige Folgen für die Gesundheit des Fötus, Neugeborenen und die emergent Erwachsene 1,2,3. Im Hinblick auf Schwangerschaft zusammenhängenden Pathologien wie Fehlschlag, intrauterine Wachstumsretardierung, Präeklampsie und mütterlichen Diabetes 4,5,6 gibt es ist ein hoher Wert gelegt auf die Entwicklung von Methoden zur Messung und Charakterisierung der Plazenta Zotten Kapillare Netzwerke. Ein großes Hindernis ist, dass die plazentale vaskuläre Netzwerken umfassen ein breites Spektrum der Skala. Die Oberfläche vaskulärer Netzwerke können so groß wie 4-5 mm im Durchmesser sein. Die terminal Zotten Kapillaren sind in der Größenordnung von 10 -20 µm im Durchmesser; die Plazenta enthält über 300 km Blutgefäße 7. Derzeit gibt es einige einfach zu bedienende und schnelle Techniken, die diesen extremen Schiff Skala erfasst werden können. Durch Mikroskopie kann bisher nur eine kleine Anzahl von Villi gerendert werden. Zum Beispiel fokussiert Jirkovska Et Al. die Plazenta Villus bei Laufzeit, kombiniert konfokale Mikroskopie mit optischen Schnittserien in 1 µm Abständen von 120 µm dicke Abschnitte erhalten; keine Angaben über die Zahl der untersuchten Proben noch Statistiken wurden 8. Kapillare Strukturen wurden identifiziert und Konturen der Zotten und Kapillaren waren handgezeichnete, mit Umzeichnungen zur Bildanalyse exportiert. Während die Autoren diskutieren die Folgen ihrer Erkenntnisse für das “wachsende Zotten vaskuläre Netzwerk”, sind solche Schlussfolgerungen problematisch, wenn nur “Begriff” (36 + Woche Gestationsalter) Gewebe untersucht wird. In ähnlicher Weise Mayo et einl. und Pearce Et Al. stützte sich auf das Gewebe im gleichen Alter, für ihre Simulationen von Blut und Sauerstoff-Transfer, aber ihre Analysen beschränkten sich auf nur wenige Begriff terminal Zotten 9,10 . Stereologie wurde auch auf die Studie der Struktur der Zotten Schiffe angewendet. Aber auch hier der Schwerpunkt wurde in der Regel auf spätere Schwangerschaften liefern Liveborn Säuglinge mit einem oder mehreren Schwangerschaft Komplikationen 11,12.

Bis vor kurzem beschränkte konfokalen Mikroskopie, Bildgebung, Gewebe Tiefen von 100-200 µm wegen Absorption der Anregung und Emission der Fluoreszenz durch das darüber liegende Gewebe 13 . Wenn Gewebe clearing und 3D Histologie häufig in der Literatur beschrieben wurden und es gibt gibt zahlreiche Methoden für Gewebe löschen viele ungeeignet für die Verwendung mit Gewebe in der Regel irreversibel beschädigt werden zelluläre Morphologie durch die hyperhydration von Proteinen oder Entfernung von Lipiden. Daher ist es nicht möglich zu überprüfen, ob diese Ergebnisse bezeichnend für das Gewebe selbst und keine Artefakte sind aus der Verarbeitung unserer Gewebe clearing-Prozess eine reversible Technik ist, die gegen traditionelle Histologie überprüfen kann. Gewebe-Clearing beinhaltet in der Regel einer der drei wichtigsten Ansätze: 1) einheitliche Abgleich des Brechungsindex (RI) der Gewebeanteile durch Untertauchen in RI passende Lösungen, die die kumulative Lichtstreuung verursacht durch kontinuierlichen lensing entfernt Schwankungen des niedrigen RI (Zytosol) und hohe RI (Protein/Lipide) Bestandteile; (2) entfernen Lipidkomponenten durch Einbettung in Hydrogel und Nutzung von Elektrophorese/Diffusion Lipidkomponenten entfernen; (3) Ausbau/Denaturierung von Protein-Struktur zum verstärkten Eindringen von Lösungsmitteln Förderung der Einheitlichkeit der RI 13. Während dieser Ansätze können Gewebe transparent zu machen und für 3D-Darstellungen von Biomarkern generiert werden, sind diese 3D-Darstellungen von zweifelhaftem klinischen Wert, da es schwierig ist, festzustellen, ob diese Bilder bezeichnend für Gewebeeigenschaften sind oder des Gewebes clearing-Prozess. Auf der anderen Seite, da unsere Gewebe löschen rückgängig gemacht werden kann Standard histologischen und/oder Immunohistochemistry einsetzbar des gleichen Gewebes zu beurteilen, ob die Veränderungen klinisch bedeutsam sind.

Diese Studie enthält eine Analyse der 47 distalen Zotten Proben aus insgesamt 23 klinisch normal und wahlweise abgebrochene Schwangerschaften zwischen 9-23 abgeschlossener Wochen Schwangerschaft und zwei voll ausgetragenen normale Lieferungen. Immunfluoreszenz Kennzeichnung der Trophoblast und Gefäßendothelien ermöglichte eine quantitative und automatisierte Analyse der Veränderungen in den Zotten vaskulären Netzwerken und ihrer Komplexität.

Mit diesem Protokoll wir isoliert und analysiert zuvor terminal Zotten und ihre Kapillare Netzwerke auf einer Skala nicht möglich. Dieser Ansatz, wenn Zotten und Kapillare Netzentwicklung über Schwangerschaft angewendet werden diese Eigenschaften identifizieren, die die Grundlage für die Geburt eines gesunden Kindes sind. Bei Anwendung auf Studien von komplizierten Schwangerschaften wird es auch klären, wann und wie die plazentalen Pathologien zu ändern, die Zotten Bäume und die Kapillare Netzwerke, die sie Scheide und wie diese fetalen Wohlbefinden beeinträchtigen.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des New York State Institute for Basic Research in Developmental Disabilities Humanforschung Ethikkommission. (1) Zotten Baum Dissektion Spülen Sie Formalin fixiert Plazenta-Gewebe mit Phosphat poliert Kochsalzlösung (PBS)14 zu entfernen das Formalin und platzieren in einer Petrischale auf der Bühne eines Mikroskops Dissektion. Verwenden Sie Skalpell und feine Pinzette um das Plazenta-Gewebe auseinander zu necken, um Z…

Representative Results

Die generierten 3D-Renderings der Kapillaren in Clustern von terminal Villi in menschlichen Plazenta von 8 Wochen gestational Alter Begriff Lieferung wurden als einzelne Cluster gezählt und skelettiert für Netzwerk-Analyse. Die Funktionseinheiten der Plazenta (Abb. 1A) sind die Villus Bäume, die eine Verlängerung der Überwasserschiffe sind, wo sie die Plazenta Parenchym (Abbildung 1Bund erwe…

Discussion

Institutional Review Board genehmigt die Auflistung der Plazenta Zotten Gewebe für Formalin Fixierung von wahlweise abgebrochene Schwangerschaften. Bevor die Verfahren durchgeführt wurden, ein kurzer Überblick über die Krankenakte mütterliches Alter, Parität, festgestellt und bestätigt das Fehlen einer zugrunde liegenden medizinischen (z.B.Bluthochdruck, Diabetes und Lupus) oder fetalen (strukturelle oder chromosomalen Anomalien, abnorme Wachstum) wurde durchgeführt. Das Datenblatt und alle gesammelten E…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der New York State Office für Menschen mit geistiger Behinderung und plazentaren Analytics LLC, New Rochelle, New York unterstützt.

Materials

10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer Macron Fine Chemicals H-121-08 General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic
Scalpel blades ThermoFisher Scientific 08-916-5B No. 11
Scalpel ThermoFisher Scientific 08-913-5
Fine forceps Electron Microscopy Services 78354-119
Micro Tube (1.7 mL) PGC Scientifics 505-201
Phosphate buffered saline Sigma D8537 PBS
Pipette VWR 52947-948 disposable, 3ml transfer pipette
Triton X-100 Boehriner Mannheim 789 704 Dilute to 0.1% from stock
Goat Serum Gibco 16210-064 Dilute to 2% in PBS solution
Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) ThermoFisher Scientific MS-1352-RQ
Rabbit Anti-CD31 antibody Abcam ab28364
green emitting (520 nm) fluorochrome  Invitrogen A11017 Alexa-Fluor 488
infrared emitting (652 nm) fluorochrome Invitrogen A21072 Alexa Fluor 633
Ethanol alcohol 200 proof Pharmco-Aaper 111000200 Dilute down to lower concentrations using PBS as needed
Solution-1 Visikol Inc. Visikol Histo-1
Solution-2 Visikol Inc. Visikol Histo-2
Skyes-Moore chambers BellCo Glass Inc. P/N 1943-11111
25 gauge needle ThermoFisher Scientific 14-826AA BD Precision Glide Needes
3 mL syringe ThermoFisher Scientific 14-823-40 BD disposable syringe
PDMS silicon sheets McMaster-Carr P/N 578T31
confocal microscope Nikon Inc. Nikon C1 Confocal Microscope
Deconvolution software Media Cybernetics AutoQuant X22
Fiji image processing software free, Open source  software available at https://fiji.sc
Hematoxylin Leica Biosystems 3801570 Component 1 of SelecTech H&E staining system
Alcoholic Eosin Leica Biosystems 3801615 Component 2 of SelecTech H&E staining system
Blue Buffer Leica Biosystems 3802918 Component 3 of SelecTech H&E staining system
Aqua Define MCX Leica Biosystems 3803598 Component 4 of SelecTech H&E staining system
Immunohistochemistry detection system ThermoFisher Scientific TL-125-QHD UltraVision Quanto Detection System HRP DAB

References

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Cite This Article
Merz, G., Schwenk, V., Shah, R., Salafia, C., Necaise, P., Joyce, M., Villani, T., Johnson, M., Crider, N. Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks. J. Vis. Exp. (133), e57099, doi:10.3791/57099 (2018).

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