Rendering tridimensionale e l'analisi di Immunolabeled, chiarito reti vascolari Villous placentare umani

La nostra comprensione della placenta in via di sviluppo e le sue patologie è, in larga misura, limitata a dedurre le relazioni spaziali tra villi adiacenti e capillari contenuti derivati da sezioni istologiche. In questo studio, abbiamo affrontato questo problema sviluppando i mezzi per generare tridimensionale rendering (3D) delle reti capillari placentare umane che sono adatte per l’analisi delle caratteristiche della rete capillare (ad es. ramificazione, solidità). Per fare questo abbiamo unito la macchiatura immunofluorescente con due prodotti di schiarimento del tessuto commerciale, Visikol-1 e Visikol-2 (di seguito come soluzione-1 e soluzione-2).

La placenta umana è un vasto complesso di vasi sanguigni situati all’interfaccia fra sangue intervillous materno e lo sviluppo del feto. Che si estende fuori dal suo inserimento nel piatto corionico, il cordone ombelicale si ramifica in una rete di arterie e vene che si ramificano per coprire la superficie corionica con una complessa rete vascolare. Loro estremità quindi penetrano giù nella profondità del disco placenta dove subiscono diverse generazioni più ramificazione e terminare in villi terminali e le loro reti capillari contenuti, il sito dello scambio di gas, sostanze nutritive, o agli arredi e metabolica rifiuti tra sangue fetale e materno.

Insulti alla rete capillare placenta durante lo sviluppo hanno conseguenze durature per la salute del feto, neonato e l’ adulto emergente ^1,2,3. In considerazione di patologie legate alla gravidanza, come aborto spontaneo, restrizione della crescita intrauterina, diabete pre-eclampsia e materna ^4,5,6 c’è un alto valore posizionato sullo sviluppo di metodi di misurazione e caratterizzazione delle reti capillari dei villi placentari. Un ostacolo importante è che le reti vascolari placentari comprendono una vasta scelta di scala. Le reti vascolari superficiali possono essere grande come 4-5 mm di diametro. I capillari dei villi terminali sono dell’ordine di 10 -20 µm di diametro; la placenta contiene oltre 300 km di vasi sanguigni ⁷. Attualmente, ci sono alcune tecniche di rapide e facile da usare che possono catturare questi estremi della scala di nave. Ad oggi, solo un piccolo numero dei villi può essere renderizzato da microscopia. Ad esempio, Jirkovska et al. focalizzata sul villo placenta al termine, combinando microscopia confocale con seriale sezioni ottiche a intervalli di 1 µm ottenuta da 120 µm spessore sezioni; non sul numero di campioni studiati né statistiche sono stati forniti dati ⁸. Strutture capillari sono stati identificati, e contorni dei villi e capillari sono stati disegnati a mano, con tracciati esportati per analisi di immagine. Mentre gli autori discutono le implicazioni delle loro scoperte per la “crescente rete vascolare dei villi”, tali conclusioni sono problematici quando il solo “legislatura” (36 + settimana di gestazione) tessuto è studiato. Allo stesso modo, Mayo et unl. e Pearce et al contato sul tessuto della stessa età, per le loro simulazioni di trasferimento di ossigeno e di flusso di sangue, ma le loro analisi sono state limitate a solo qualche termine, villi terminali ^9,10 . Stereology è stato applicato anche allo studio della struttura dei vasi dei villi. Ma ancora una volta, il focus è stato generalmente su gravidanze consegna liveborn infanti con uno o più gravidanza complicanze ^11,12.

Fino a poco tempo, microscopia confocale era limitata a imaging nelle profondità del tessuto di 100-200 µm a causa di assorbimento di eccitazione e di emissione di fluorescenza entro il tessuto sovrastante ¹³ . Se tessuto schiarimento e l’istologia 3D sono state ampiamente descritte in letteratura e ci sono numerosi metodi per il tessuto di compensazione molti sono adatte all’uso con i tessuti in generale, quanto danneggiare irreversibilmente morfologia cellulare attraverso il hyperhydration di proteine o rimozione dei lipidi. Di conseguenza, non è possibile convalidare che questi risultati sono indicativi del tessuto stesso e non artefatti da elaborazione considerando che il nostro tessuto processo di compensazione è una tecnica reversibile che è in grado di convalidare l’istologia tradizionale. Schiarimento del tessuto generalmente coinvolge uno dei tre approcci principali: 1) uniforme di corrispondenza dell’indice di rifrazione (RI) delle componenti del tessuto da immersione in soluzioni corrispondenti RI, che rimuove la dispersione della luce cumulativa causata dalla lente a causa di continuo fluttuazione di RI basso (citosol) e alta RI (proteine/lipidi) costituenti; 2) rimozione componenti lipidici mediante l’incorporamento in idrogel e utilizzando l’elettroforesi/diffusione per rimuovere componenti lipidici; 3) espansione/denaturazione della struttura della proteina per consentire una maggiore penetrazione di solventi per incoraggiare l’uniformità di RI ¹³. Mentre questi approcci possono eseguire il rendering di tessuti trasparenti e consentire rappresentazioni 3D di biomarcatori per essere generato, queste rappresentazioni 3D sono di discutibile valore clinico in quanto è difficile stabilire se queste immagini sono indicative di proprietà di tessuto o del tessuto processo di compensazione. D’altra parte, poiché il nostro tessuto di compensazione è reversibile standard istologico e/o immunohistochemistry può applicarsi al tessuto stesso per valutare se le alterazioni sono clinicamente significative.

Questo studio presenta un’analisi di 47 distale villi coriali ottenuti da un totale di 23 gravidanze clinicamente normale o elettivamente conclusi tra 9-23 completato weeks’ gestazione e due consegne normali di termine. Immunofluorescenza di etichettatura del trofoblasto ed endoteli ha permesso un’analisi quantitativa e automatizzata delle modifiche le reti vascolari dei villi e della loro complessità.

Con questo protocollo, abbiamo isolato e analizzati in precedenza villi terminali e le loro reti capillari su una scala non è possibile. Questo approccio, quando applicato allo sviluppo della rete dei villi e capillare in tutta la gestazione identificherà quelle proprietà che sono il fondamento per la nascita di un bambino sano. Quando applicata a studi di gravidanze complicate, chiarirà anche quando e come le patologie placentare modificare gli alberi dei villi e le reti capillari che hanno guaina, e come questi incidono sul benessere fetale.