Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

Nosso entendimento de suas patologias e a placenta em desenvolvimento é, em grande medida, limitado para inferir relações espaciais entre vilosidades adjacentes e capilares contidos derivados de cortes histológicos. Neste estudo, abordámos esta questão ao desenvolver os meios para gerar os renderizações tridimensionais (3D) das redes de capilares placentários humanos que são adequados para análises das características da rede capilar (por exemplo, ramificação, solidez). Para fazer isso que combinamos coloração imunofluorescente com dois produtos de limpeza do tecido comercial, Visikol-1 e Visikol-2 (referido abaixo como solução-1 e 2 de solução).

A placenta humana é um vasto complexo de vasos sanguíneos localizados na interface entre o sangue da mãe intervillous e o desenvolvimento do feto. Estendendo-se para fora de sua inserção na placa coriônica, o cordão umbilical ramifica-se em uma rede de artérias e veias que ramify para cobrir a superfície coriônica com uma elaborada rede vascular. Suas extremidades então penetram para o interior ou a profundidade do disco placentário onde eles passam por várias gerações mais ramificação e terminam no terminal villi e suas redes capilares contidos, o site da troca de gases, nutrientes, e metabólica resíduos entre o sangue fetal e materno.

Insultos à rede capilar placentário durante o desenvolvimento tem consequências duradouras para a saúde do feto, recém-nascido e o adulto emergente ^1,2,3. Tendo em conta as patologias relacionadas com a gravidez, como aborto, restrição de crescimento intra-uterino, diabetes pré-eclâmpsia e maternal ^4,5,6 lá é um alto valor colocado no desenvolvimento de métodos de medição e caracterização de redes capilares das vilosidades da placenta. Um grande obstáculo é que redes vasculares placentárias abrangem uma vasta gama de escala. As redes de superfície vasculares podem ser tão grandes como 4-5 mm de diâmetro. Os capilares das vilosidades terminais são da ordem de 10 -20 µm de diâmetro; a placenta contém mais de 300 km de vasos sanguíneos ⁷. Presentemente, existem algumas técnicas de rápida e fácil de usar que podem capturar esses extremos da escala de navio. Até à data, apenas um pequeno número de vilosidades pode ser processado por microscopia. Por exemplo, Jirkovska et al enfoca as vilosidades da placenta no prazo, combinando a microscopia confocal com seriais seções óticas intervalos 1 µm obtidos de 120 µm de espessura seções; Não há dados sobre o número de amostras estudadas nem estatísticas foram fornecidos ⁸. Estruturas capilares foram identificadas, e contornos de vilosidades e capilares foram desenhados à mão, com traçados exportados para análise de imagem. Enquanto os autores discutem as implicações de suas descobertas para a “rede vascular vilosa crescente”, tais conclusões são problemáticos, quando apenas “termo” (36 + semana idade gestacional) tecido é estudado. Da mesma forma, Mayo et uml. e. Pearce et al baseou-se no tecido da mesma idade, para suas simulações de transferência de fluxo e oxigênio do sangue, mas suas análises eram limitados a apenas algumas termo, vilosidades terminal ^9,10 . Stereology também foi aplicada ao estudo da estrutura dos vasos das vilosidades. Mas, novamente, o foco tem sido geralmente em gravidezes posteriores entregando bebês nascidos vivos, com uma ou mais gravidez complicações ^11,12.

Até recentemente, microscopia confocal foi limitada a imagem para profundidades de tecido de 100-200 µm por causa da absorção de excitação e emissão de fluorescência pela tecido sobrejacente ¹³ . Apesar de tecido limpando e histologia 3D têm sido amplamente descritos na literatura e há inúmeros métodos para tecido limpar muitos são inadequados para uso com tecidos em geral, pois danificar irreversivelmente morfologia celular através do hyperhydration de proteínas ou remoção de lipídeos. Portanto, não é possível validar que estes resultados são indicativos do próprio tecido e não artefatos de processamento considerando nosso tecido em processo de compensação é uma técnica reversível que é capaz de validar contra histologia tradicional. Clareira de tecido geralmente envolve uma das três abordagens principais: 1) correspondência uniforme de índice de refração (RI) dos componentes do tecido por submersão em soluções correspondentes do RI, que remove o espalhamento de luz cumulativo causado da lente devido à contínua flutuação de baixo RI (citosol) e altas constituintes de RI (proteína/lipídios); 2) removendo componentes lipídicos por meio de incorporação em hidrogel e utilizando eletroforese/difusão para remover componentes lipídicos; 3) expansão/desnaturação da estrutura da proteína para permitir que o aumento da penetração dos solventes para incentivar a uniformidade do RI ¹³. Enquanto essas abordagens podem processar tecidos transparentes e permitem representações 3D de biomarcadores para ser gerado, essas representações 3D são de valor questionável clínico como é desafiador para determinar se estas imagens são indicativas de propriedades de tecido ou do tecido processo de compensação. Por outro lado, desde que nosso tecido de compensação é reversível padrão histológico e/ou imuno-histoquímica pode ser aplicado no mesmo tecido para avaliar se as alterações são clinicamente significativas.

Este estudo apresenta uma análise de 47 amostras das vilosidades distais obtido um total de 23 gravidezes clinicamente normais e electively encerrados entre 9-23 concluídas semanas gestação e duas entregas normais do termo. Imunofluorescência rotulagem do trofoblasto e endothelia permitiu uma análise quantitativa e automatizada de alterações nas redes de vascular vilosa e sua complexidade.

Com este protocolo, nós isolado e analisado villi terminal e suas redes capilares em uma escala não é possível anteriormente. Esta abordagem, quando aplicada ao desenvolvimento das vilosidades e capilar rede através de gestação irá identificar as propriedades que são a base para o nascimento de uma criança saudável. Quando aplicado a estudos de gravidezes complicadas, ele também esclarecer quando e como as patologias da placenta modificar as árvores das vilosidades e as redes de capilares que eles da bainha, e como estas afectem bem-estar fetal.