Summary

Ratón adulto DRG explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección Viral y la neuroplasticidad

Published: March 09, 2018
doi:

Summary

En este informe, se destacan las ventajas de las culturas organotypic y disociadas cultivos primarios de ganglios de raíz dorsal derivadas de ratón para investigar una amplia gama de mecanismos asociados a la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la respuesta a la infección viral.

Abstract

Este protocolo describe un modelo ex vivo de raíz dorsal de ratón derivados ganglios (DRG) explante y en vitro derivados de DRG Co cultura de disociado de las neuronas sensoriales y las células glial satélite. Estos son modelos versátiles y útiles para investigar una variedad de respuestas biológicas asociadas con condiciones fisiológicas y patológicas del sistema nervioso periférico (PNS) que van desde la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la infección viral. El uso de explantes de DRG es científicamente ventajoso en comparación con las células simples modelos por múltiples razones. Por ejemplo, como una cultura organotypic, explante GRD permite a transferencia ex vivo de toda una red neuronal como el microambiente extracelular que juegan un papel significativo en todas las funciones neuronales y gliales. Además, DRG explantes pueden también mantener ex vivo para varios días y las condiciones de cultivo pueden ser perturbadas como deseado. Además, el DRG cosechado puede ser disociado más en una cultura Co en vitro de neuronas sensoriales primarias y células glial satélite para investigar la interacción neuronal-glial, neuritogenesis, cono axonal interacción con el medio extracelular microambiente y más general, cualquier aspecto asociado con el metabolismo neuronal. Por lo tanto, el sistema de DRG-explante ofrece una gran flexibilidad para estudiar una amplia gama de eventos relacionados con las condiciones biológicas, fisiológicas y patológicas de una manera rentable.

Introduction

En este manuscrito, se presenta un método para obtener un modelo ex vivo de organotypic de un sistema de modelo de ratón derivado DRG como un microambiente como tejido conservado para investigar una amplia gama de respuestas biológicas a los insultos PNS desde neuronal-glial interacción, neuroplasticidad, marcadores inflamatorios, infección viral. Además, hemos desarrollado un protocolo para crear una cultura co primaria de derivados de DRG solo neuronas sensoriales y las células satélite.

El DRG son gris-materia-unidades satélite situadas fuera de sistema nervioso central (SNC) a lo largo de las raíces espinales dorsales de los nervios espinales. El DRG, situado en la proximidad de los agujeros intervertebrales, las neuronas sensoriales pseudounipolares casa y células gliales por satélite. Las neuronas pseudounipolares tienen una sola neurita que se divide en un proceso periférico lleva entradas somáticas y viscerales de objetivos periféricos al cuerpo de la célula y un proceso central que envía información sensorial del cuerpo celular en el SNC. Una cápsula de tejido conectiva define y aísla esta agrupación periférica de neuronas y células gliales del SNC. Sin migración celular postnatal desde el DRG o nunca se ha descrito y un nicho de células madre local es responsable de eventos neurógeno, que ocurre a lo largo de la vida1. Por lo tanto, este modelo es particularmente adecuado para el estudio de la neurogénesis adulta, axonogenesis, respuesta a la lesión traumática y la célula muerte2,3,4,5,6,7 ,8,9 .

En el campo de Neurorregeneración, el DRG extraídas en vivo y explantado en vitro reproduce axonotmesis, una condición de la lesión en que axones son totalmente roto y el cuerpo neuronal de la célula está desconectada del destino inervados10 ,11. Es bien sabido que lesión periférica del nervio puede causar expresión génica disminución y aumento en el DRG y muchos de estos cambios son el resultado de procesos regenerativos pero muchos también pueden ser el resultado de la respuesta inmune u otra respuesta de las células no neuronales. Mediante el uso de un ex vivo sistema de DRG aislado, algunos de esta complejidad se elimina y vías mecanicistas pueden investigarse más fácilmente.

Además de su papel central en transporte entradas sensoriales al SNC, la abundancia de receptores para muchos neurotransmisores como GABA12,13,14,15 a nivel del soma neuronal, así como evidencia de excitación de Cruz interneuronal puede sugerir que DRG son sofisticados integradores preliminares de entradas sensoriales16,17. Estos nuevos hallazgos confieren al explante DRG las características de un sistema de red mini-neuronal similar a otros modelos “mini cerebro”, que son específicos de tejido nervioso organitas utilizado para campos experimentales más amplio de investigación y terapéutica enfoque a enfermedades neurológicas18,19. Estas evidencias junto con el hecho de que el GRD es un grupo discreto y bien definido de tejido neuronal rodeado por una cápsula de tejido conectiva, hacen que sea un órgano adecuado para el trasplante de vivo ex .

Cultivo ratón DRG presenta una opción atractiva multicelular modelo pathophysiologies humanas debido a las similitudes estructurales y genéticas entre las especies. Además, un gran repositorio de cepas de ratón transgénico es muy propicio para futuros estudios mecanicistas. Extensión del neurite tanto durante el desarrollo y después de la lesión requiere interacciones mecánicas entre crecimiento cono y sustrato20,21. Nano – y micro-patrón sustratos se han utilizado como herramientas para dirigir la consecuencia del neurite y demostrar su capacidad para responder a las características topográficas en sus microambientes. Han demostrado las neuronas para sobrevivir, se adhieren, migran y orientar sus axones para navegar características superficiales como surcos en sustratos,,2223. Sin embargo, estos estudios han utilizado típicamente líneas de cultivo de células y es difícil predecir cómo primarios neuronales células voluntad responde a pautas bien definidas, física en vivo o ex vivo.

El modelo de explante ex vivo del ratón DRG utilizado para esta propuesta imita la interacción célula-célula real y señales bioquímicas que rodea los axones creciente. Entre muchos diferentes paradigmas experimentales que van desde la regeneración axonal, desarrolló la producción, neuroinflamación, el DRG explante modelo continúa sirviendo como una herramienta valiosa para investigar el aspecto de la infección y la latencia viral en sensorial los ganglios24,25,26,27.

El sistema nervioso (NS) en general es blanco para infecciones virales28,29,30. Mayoría de los virus infecta las superficies de células epiteliales y endoteliales y hace su camino desde la superficie del tejido a NS a través de nervios periféricos las fibras sensoriales y motoras. En particular, el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) después de una infección inicial en las células epiteliales establece un estado de vida latente en los ganglios sensoriales preferiblemente, el DRG del PNS31,32. HSV-1 neuroptropic capacidad de infectar el PNS en último término conduce a enfermedades neurológicas33.

Protocol

Todos los procedimientos incluyendo el uso de los animales han sido aprobados por los protocolos de aprobado por la Junta de revisión institucional (IACUC Midwestern University). 1. recolección de DRG de embriones de ratón Eutanasia a los ratones adultos por método de asfixia (CO2) seguidos de la decapitación. Inmediatamente proceder a extirpar quirúrgicamente de la columna vertebral. Exponer la columna vertebral por el corte hacia abajo d…

Representative Results

Múltiples aspectos de la interacción de la neuroplasticidad y la neurona y el medio ambiente se pueden investigar mediante DRG y un modelo de cultura de célula disociados. Comenzamos los estudios aislando un explante de GRD y las células disociadas derivadas de DRG como esquemáticamente representadas en la figura 1. Modelos de células y tejidos pueden ser analizados usando una variedad de técnicas moleculares como la inmunofluorescencia, Western blot, ensayos de genómicos y otras té…

Discussion

El modelo ex vivo DRG es muy útil para investigar una amplia gama de eventos como interacción neurona-glia, así como el efecto del microambiente en ambos el metabolismo neuronal y glial37. Además, el DRG-modelo podría utilizarse como una herramienta rentable para abordar preguntas relevantes sobre el mecanismo patogénico y asociado marcadores desarrollando ex vivo sistemas para fase aguda crónica y latente de la infección o de una determinada enfermedad. Además, una bibl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos sinceramente las instalaciones centrales de la proyección de imagen en Midwestern Universidad (Uth) y el grupo de estudiantes [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo y Casey Sigerson] por sus contribuciones en cultivo celular y trabajo de imagen. Este trabajo de investigación fue apoyado por donaciones de la Uth Intramural fondos fondos de puesta en marcha M.F. e investigación a V.T.

Materials

Adult Mice NIH/Swiss Harlan Laboratories
35mm petri dish Cell Treat 229635
Matrigel ECM Sigma-Aldrich E1270 gelatinous protein mixture
F12 Media Gibco 11765-054 *Part of SFM media
Collagenase IV Sigma-Aldrich C5138
Trypsin Sigma-Aldrich 25200-056
FBS Sigma-Aldrich F6178
0.22um filter BD Falcon 352350
Neurobasal media Gibco 10888-022
B27 supplement Gibco 17504-044 Supplement for neuronal culture
PSN antibiotics Gibco 15640-055 *Part of SFM media
Antibiotic mixture
L-glutamate Sigma-Aldrich G7513 *Part of SFM media
NGF Alomone Labs N-100 Nerve growth factor
Laminin coated coverslide Neuvitro GG-14-Laminin
ONPG subtrate Pierce 34055
X-gal Invitrogen 15520034
Antibody anti-B-tubulin Sigma-Aldrich T8328 1:2000 dilution
Antibody anti-peripherin Millipore AB1530 1:1000 dilution
Hoechst dye Thermo Fisher 62249 1.5 µM final concentration
Anti-heparan sulfate US Biological H1890-10 0.180555556
Anti gD antibody Virostat 196 1:10 dilution
BSA  Sigma-Aldrich A2153-100G *Part of SFM media
BME Gibco 21010-046 *Part of SFM media
Glucose Sigma-Aldrich G7021-1KG *Part of SFM media
KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) Gibco 51300-044 *Part of SFM media
Vitamin-C Sigma-Aldrich A4403 *Part of SFM media
Putrescine Sigma-Aldrich P7505 *Part of SFM media
488 (goat anti-mouse) Life Technologies A11029
Cy3 (goat anti-rabbit) Jackson Immunoresearch laboratories 111-165-003
Normal Goat serum  Vector S-1000
Formalin Solution Sigma-Aldrich HT5014-120ML
PBS Gibco 10010-031
Triton-X Sigma-Aldrich T9284-500ML
VectaShield Vector H-1500 Flurescence mount
Diamond White Glass Coverslides Globe Scientific 1380-20

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Fornaro, M., Sharthiya, H., Tiwari, V. Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection. J. Vis. Exp. (133), e56757, doi:10.3791/56757 (2018).

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