الكبار الماوس DRG Explant ونأت بنماذج الخلية للتحقيق في أعصاب والردود على الإهانات البيئية بما في ذلك العدوى الفيروسية
Summary
في هذا التقرير، هي أبرز مزايا أورجانوتيبيك الثقافات والثقافات الأولية ينتابها من العقد الجذرية الظهرية المستمدة من الماوس للتحقيق في طائفة واسعة من الآليات المرتبطة بالخلايا العصبية الدبقية التفاعل، أعصاب، نيوروينفلاميشن، واستجابة للعدوى الفيروسية.
Abstract
ويصف هذا البروتوكول نموذجي السابقين فيفو الجذرية الظهرية المستمدة من الماوس ganglia (DRG) explant في المختبر المستمدة من الرسم المشارك الثقافة وينتابها من الخلايا العصبية الحسية والخلايا الدبقية من الأقمار الصناعية. هذه نماذج مفيدة وتنوعاً للتحقيق في مجموعة متنوعة من الاستجابات البيولوجية المرتبطة بالظروف الفسيولوجية والمرضية للنظام العصبي المحيطي (السندات الإذنية) تتراوح من العصبية الدبقية التفاعل، أعصاب، نيوروينفلاميشن، والعدوى الفيروسية. استخدام الرسم اكسبلانت مفيد علمياً مقارنة بنماذج مبسطة الخلايا المفردة لأسباب متعددة. على سبيل المثال، كثقافة أورجانوتيبيك، يسمح DRG explant السابقين فيفو نقل شبكة الخلايا العصبية كاملة بما في ذلك المكروية خارج الخلية التي تلعب دوراً هاما في جميع وظائف الخلايا العصبية والدبقيه. علاوة على ذلك، DRG explants يمكن أيضا الإبقاء على السابقين فيفو لعدة أيام وظروف الثقافة يمكن أن تكون قلق كالمطلوب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن فصل الرسم المقطوع كذلك إلى في المختبر المشارك ثقافة الخلايا العصبية الحسية الأولية والخلايا الدبقية الساتلية للتحقيق في تفاعل الخلايا العصبية الدبقية، نيوريتوجينيسيس، محواري مخروط التفاعل مع الخلية المكروية، وأكثر العامة، أي الجوانب المرتبطة بعملية الأيض العصبية. ولذلك، يوفر نظام DRG-explant قدرا كبيرا من المرونة لدراسة مجموعة واسعة من الأحداث المتصلة بالظروف البيولوجية والفسيولوجية والمرضية بطريقة فعالة من حيث التكلفة.
Introduction
في هذه المخطوطة، يمكننا تقرير أسلوب للحصول على نموذج السابقين فيفو أورجانوتيبيك نظام نموذج الرسم الماوس المستمدة المكروية مثل الأنسجة محفوظة للتحقيق في طائفة واسعة من الاستجابات البيولوجية للشتائم السندات الإذنية التي تتراوح من العصبية الدبقية التفاعل، أعصاب، علامات التحريضية، للعدوى الفيروسية. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن زيادة تطوير بروتوكول لإنشاء ثقافة المشارك الأولية المستمدة من الرسم واحد الخلايا العصبية الحسية والخلايا الأقمار الصناعية.
الرسم الأقمار الصناعية الرمادية-المسألة-وحدات يقع خارج الجهاز العصبي المركزي (CNS) على طول العمود الفقري الجذور الظهرية للأعصاب في العمود الفقري. الرسم، يقع بالقرب من الثقب الفقرية والبيت بسيودونيبولار من الخلايا العصبية الحسية والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية. وتتميز الخلايا العصبية بسيودونيبولار نورت واحد أن يقسم إلى عملية طرفية تحمل جسدية والحشوي المدخلات من الأهداف الهامشية لخلايا الجسم، وعملية مركزية التي تقدم المعلومات الحسية من الجسم خلية في الجهاز العصبي المركزي. يعرف كبسولة ضام ويعزل هذه المجموعة الطرفية للخلايا العصبية والخلايا الدبقية من الجهاز العصبي المركزي. قد وصف لا الهجرة خلية بعد الولادة من الرسم أو من أي وقت مضى، ومكانه خلايا الجذعية محلية مسؤولة عن الأحداث العصبية التي تحدث في جميع أنحاء الحياة1. ولذلك، هذا النموذج مناسبة خاصة لدراسة الخلايا الكبار، أكسونوجينيسيس، واستجابة للآفة المؤلمة، وخلية الموت2،3،4،،من56،7 ،،من89 .
في ميدان نيوروريجينيريشن، الرسم المقطوع من فيفو واكسبلانتيد في المختبر يستنسخ axonotmesis، شرط ضرر في محاور عصبية التي هي مقطوعة تماما والجسم الخلايا العصبية مفصول عن الهدف إينيرفاتيد10 ،11. فمن المعروف جيدا أن يمكن أن يسبب إصابات الأعصاب الطرفية التعبير الجيني المنخفض وزيادة في الرسم والعديد من هذه التغييرات نتيجة لعمليات التجدد لكن الكثير قد تكون أيضا نتيجة للاستجابة المناعية أو رد آخر من الخلايا غير العصبية. باستخدام السابقين فيفو هو إزالة النظام من الرسم معزولة، بعض من هذا التعقيد ومسارات ميكانيكية يمكن أن يحقق بسهولة أكبر.
بالإضافة إلى دورها الرئيسي في نقل المدخلات الحسية إلى الجهاز العصبي المركزي، وفرة مستقبلات للعديد من أجهزة الإرسال العصبية، بما في ذلك غابا12،13،،من1415 على مستوى سوما الخلايا العصبية، وكذلك قد تشير أدلة إثارة عبر إينتيرنيورونال أن الرسم مدمجو أولية متطورة من المدخلات الحسية16،17. هذه النتائج الجديدة تضفي على DRG explant خصائص نظام شبكة الخلايا العصبية ميني مشابهة لنماذج أخرى “الدماغ المصغر”، التي محددة النسيج العصبي أورجانويدس المستخدم للحقول التجريبية أوسع نطاقا للتحقيق والعلاجية نهج للأمراض العصبية18،19. هذه الأدلة إلى جانب حقيقة أن الرسم مجموعة منفصلة ومحددة تحديداً جيدا من الأنسجة العصبية محاطة بكبسولة ضام، جعله جهازا مناسباً لزرع الأعضاء السابقين فيفو .
الماوس تثقيف الرسم يمثل خياراً جذاباً متعددة الخلايا نموذج باثوفيسيولوجيس البشرية بسبب التشابه الهيكلي والوراثية بين الأنواع. بالإضافة إلى ذلك، إلى مستودع كبير للسلالات المحورة وراثيا الماوس الغاية تفضي إلى الدراسات الميكانيكية في المستقبل. يتطلب ملحق نورت خلال التنمية، وبعد إصابة ميكانيكية التفاعلات بين النمو مخروط والركيزة20،21. استخدمت ركائز نانو والصغرى منقوشة كأدوات توجيه ثمرة نورت وإثبات قدرتها على الاستجابة للسمات الطوبوغرافية في ميكرونفيرونمينتس بهم. وقد أظهرت الخلايا العصبية للبقاء على قيد الحياة، والالتزام، وترحيل، وتوجيه على محاور عصبية للتنقل بين السمات السطحية مثل الأخاديد في ركائز22،23. ومع ذلك، استخدمت هذه الدراسات عادة إلى خطوط الخلايا المزروعة ومن الصعب التنبؤ بكيفية الخلايا العصبية الأولية سوف تستجيب لمنبهات محددة تحديداً جيدا، والمادية في فيفو أو السابقين فيفو.
يحاكي النموذج explant السابقين فيفو الماوس الرسم المستخدمة لهذا الاقتراح التفاعل الحقيقي خلية خلية والبيوكيميائية العظة المحيطة بمحاور عصبية المتزايد. بين العديد من مختلف نماذج تجريبية تتراوح بين محواري التجدد، إنتاج نيوروسفيري، نيوروينفلاميشن، اكسبلانت الرسم نموذج ما زال بمثابة أداة قيمة للتحقيق الجانب العدوى والكمون الفيروسي داخل الحسية ganglia24،25،،من2627.
بشكل عام الجهاز العصبي (NS) هدفا للعدوى الفيروسية28،،من2930. معظم الفيروسات تصيب سطوح الخلايا الظهارية وبطانية وتشق طريقها من الأنسجة السطحية إلى NS عبر الأعصاب الطرفية الألياف الحسية والحركية. على وجه الخصوص، نوع فيروس الحلأ البسيط 1 (هامبورغ-1) بعد عدوى أولية في الخلايا الظهارية يرسي كمون مدى الحياة في العقد الحسية ويفضل الرسم31،السندات الإذنية32. قدرة نيوروبتروبيك هامبورغ-1 إصابة السندات الإذنية يؤدي في نهاية المطاف إلى33من الأمراض العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج الرسم السابقين فيفو مفيدة للغاية للتحقيق في طائفة واسعة من الأحداث مثل التفاعل إطلاق العصبية وكذلك أثر المكروية على كلا استقلاب الخلايا العصبية والدبقيه37. علاوة على ذلك، يمكن استخدام الرسم-النموذج كأداة فعالة من حيث التكلفة لمعالجة المسائل ذات الصلة فيما يتعلق ب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر صدق التصوير الأساسية-المرفق في جامعة الغرب الأوسط (مو) والمجموعة من الطلاب [سنغ تشانمولي، كريستوفر ديبولينا، داريل جيامبالفو، وكيسي سيجرسون] لمساهماتها في خلية ثقافة وتصوير العمل. هذا العمل البحثي وأيده Intramural مو منح التمويل لصناديق بدء م. ف. والبحوث V.T.
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. 신경과학. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. 신경과학. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. 신경과학. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A., McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Whitley, R., Kimberlin, . D. W., Prober, C. G., Arvin, A., et al. . Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
