Explant של עכבר למבוגרים DRG הפומבית תא מודלים לחקור והנוירולוגיה הפלסטית ואת התגובות עלבונות סביבתי כולל זיהום ויראלי
Summary
בדו ח זה, היתרונות של תרבויות organotypic ותרבויות הפומבית העיקרי של העכבר, נגזר שורש העזוב הגרעינים מודגשים לחקור מגוון רחב של מנגנונים הקשורים אינטראקציה נוירון-גליה, והנוירולוגיה הפלסטית, neuroinflammation, בתגובה זיהום ויראלי.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר מודל ex-vivo של העכבר, נגזר שורש העזוב הגרעינים (DRG) explant במבחנה DRG-derived משותף ותרבות של חלופה מועדפת החישה הניריונים ותאי גלייה בלוויין. אלו דגמים שימושי ופסיביות לחקור מגוון רחב של תגובות ביולוגיות המשויך בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים של מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית) החל אינטראקציה נוירון-גליה, והנוירולוגיה הפלסטית, neuroinflammation, זיהום ויראלי. השימוש DRG explant הוא מדעית יתרון בהשוואה למודלים פשטנית תאים בודדים מסיבות רבות. למשל, כמו תרבות organotypic, explant DRG מאפשר העברה ex-vivo של הרשת העצבית כולה כולל את microenvironment חוץ-תאית לשחק תפקיד משמעותי כל הפונקציות עצביים, גליה. עוד יותר, DRG explants יכול גם להישמר שמחוץ במשך מספר ימים ועל תנאי התרבות יכול להיות מוטרד ככל הרצוי. בנוסף, הרפובליקה שנקטפו יכול להיות עוד יותר הפומבית לתוך במבחנה שיתוף תרבות של נוירונים סנסוריים העיקרי ותאי גלייה בלוויין לחקור אינטראקציה עצביים-גליה, neuritogenesis, חרוט עצב אינטראקציה עם חוץ-תאית microenvironment, כללי יותר, כל היבט המשויך חילוף החומרים עצביים. לכן, המערכת DRG-explant מציע מידה רבה של גמישות ללימוד מגוון רחב של אירועים הקשורים לתנאי ביולוגי, פיזיולוגיים ופתולוגיים באופן יעיל.
Introduction
כתב יד זה, אנחנו מדווחים שיטה לקבל מודל לשעבר ויוו organotypic של מערכת מודל DRG העכבר נגזר כמו microenvironment כמו רקמות שהשתמרו לחקור מגוון רחב של תגובות ביולוגיות עלבונות מערכת העצבים ההיקפית החל נוירון-גליה אינטראקציה, והנוירולוגיה הפלסטית, סמנים דלקתיים, לזיהום ויראלי… בנוסף, בהמשך פיתחנו פרוטוקול כדי ליצור תרבות משותפת העיקרי של נגזר DRG נוירונים סנסוריים יחיד ותאים בלוויין.
הרפובליקה הם בלוויין אפור-חומר-יחידות ממוקם מחוץ למערכת העצבים המרכזית (CNS) לאורך עמוד השדרה הגבי שורשי עצבים בעמוד השדרה. הרפובליקה, הממוקם בסמיכות foramina בין-חולייתי, בית pseudounipolar החישה הניריונים, לוויין גלייה. הנוירונים pseudounipolar כוללים neurite יחיד זה מתפצל תהליך היקפיים נושאת תשומות סומאטית ואת הקרביים של מטרות היקפיים לגוף התא, תהליך מרכזי שישלח מידע חושי מהגוף תא לתוך מערכת העצבים. הלקט חיבור מגדיר ומבודד מקבץ היקפיים של נוירונים ותאי גלייה של מערכת העצבים. אין העברה תא כמחנכת או ממנו הרפובליקה פעם שתיארנו, גומחת תאי גזע מקומי אחראי neurogenic אירועים המתרחשים לאורך כל החיים1. לכן, מודל זה מתאים במיוחד ללמוד נוירוג’נסיס למבוגרים, axonogenesis, תגובה טראומטית הנגע ו תא מוות2,3,4,5,6,7 8, ,9 .
בתחום neuroregeneration, הרפובליקה שנקטפו ויוו , explanted במבחנה מתרבה axonotmesis, מצב הפציעה אקסונים אשר מלא במחוז, הגוף תאים עצביים מנותקת מן המטרה innervated10 ,11. זה ידוע כי פגיעה במערכת העצבים ההיקפית יכול לגרום ירידה ו מוגברת גנים של הרפובליקה, רבים של שינויים אלה הם תוצאה של תהליכי הרגנרציה אך רבים יכול להיות גם תוצאה של התגובה החיסונית או תגובה נוספת מתאי שאינם עצבית. על-ידי שימוש של ex-vivo מערכת מבודדת DRG, חלק המורכבות הזו יוסר ולא מסלולים מכניסטית יכולה להיחקר בקלות רבה יותר.
מלבד תפקידה המרכזי להולכת תשומות חושי אל מערכת העצבים, השפע של קולטני נוירוטרנסמיטרים רבים כולל גאבא12,13,14,15 ברמה של סומא עצביים וכן עדות interneuronal קרוס-עירור יכול להציע כי DRG הם מתוחכמים אינטגרטורים ראשוני של תשומות חושים16,17. אלו הממצאים החדשים להתייעץ כדי explant DRG המאפיינים של מערכת רשת עצבית מיני הדומה דגמים אחרים “מיני המוח”, אשר organoids עצבני-רקמות ספציפיות בשימוש עבור שדות ניסיוני רחבה יותר של החקירה וטיפוליים הגישה מחלות נוירולוגיות18,19. הראיות הללו יחד עם העובדה כי הרפובליקה היא אשכול נפרד ומוגדר היטב של הרקמה העצבית מוקף קפסולה חיבור, לעשות את זה איבר מתאים עבור השתלת ex-vivo .
העכבר culturing DRG מציג אפשרות multicellular מושכת לדגם pathophysiologies האדם בשל דמיון גנטי מבניים בין המינים. בנוסף, מאגר גדול של זנים העכבר הטרנסגניים היא תורמת מאוד מכניסטית מחקרים עתידיים. סיומת Neurite במהלך הפיתוח והן לאחר פציעה דורש מכני האינטראקציות בין צמיחה חרוט, המצע20,21. ננו, מיקרו-בדוגמת סובסטרטים שימשו ככלים neurite תוצר ישיר של להפגין את היכולת שלהם מגיבים לתכונות הטופוגרפי ב- microenvironments שלהם. נוירונים הוכחו לשרוד, דבקים, להעביר, אוריינט אקסונים שלהם כדי לנווט תכונות פני השטח כגון חריצים סובסטרטים22,23. עם זאת, מחקרים אלה נעזרו בדרך כלל שורות תאים בתרבית וזה קשה לחזות איך ראשי עצביים תאים הרצון להשיב רמזים מוגדרים היטב, פיזית ויוו או ex-vivo.
הדגם explant ex-vivo של העכבר DRG המשמש עבור הצעה זו מחקה את התא אמיתי-תא אינטראקציה, סימנים ביוכימיים סביב האקסונים הגדלים. בקרב רבים שונים פרדיגמות ניסיוני ועד התחדשות עצב, ייצור neurosphere, neuroinflammation, הרפובליקה explant דגם ימשיך לשמש כלי רב ערך לחקור ההיבט זיהום וההשהיה ויראלי בתוך החישה הגרעינים24,25,26,27.
באופן כללי, מערכת העצבים (NS) הוא יעד עבור זיהומים נגיפיים28,29,30. רוב הווירוסים להדביק תאים אפיתל, אנדותל משטחים ולעשות דרכם מן הרקמה משטח NS דרך העצבים ההיקפית סיבי ורפלקסי. בפרט, נגיף הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) לאחר זיהום ראשוני בתאי אפיתל יוצר השהיה חיים ארוך בשנת הגרעינים חושית רצוי, הרפובליקה של31,מערכת העצבים ההיקפית32. HSV-1 neuroptropic יכולת להדביק את מערכת העצבים ההיקפית מוביל בסופו של דבר מחלות נוירולוגיות33.
Protocol
Representative Results
Discussion
המודל DRG ex-vivo הוא מאוד שימושי לחקור מגוון רחב של אירועים כגון אינטראקציה נוירון-עכשיו, דונלד, כמו גם השפעת microenvironment על שני החומרים עצביים, גליה37. עוד, DRG-המודל יכול לשמש ככלי חסכונית כדי לטפל שאלות רלוונטיות לגבי מנגנון פתוגניים ומקושרת סמנים על ידי פיתוח ex- vivo מערכות ב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים הדמיה הליבה-המתקן ב אוניברסיטת נברסקה (MWU) לבין הקבוצה של תלמידים [Chanmoly סנג, כריסטופר Dipollina, דריל Giambalvo ואת קייסי Sigerson] על תרומתם של תרבית תאים והדמיה עבודה. עבודת מחקר זו נתמכה על ידי גרנט Intramural של MWU מימון כדי M.F. ומחקר ראשונית V.T.
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. 신경과학. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. 신경과학. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. 신경과학. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A., McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Whitley, R., Kimberlin, . D. W., Prober, C. G., Arvin, A., et al. . Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
