Un análisis de la inmunofluorescencia celular Simple para detectar autoanticuerpos contra el Receptor N-metil-D-Aspartato (NMDA) en sangre
Summary
Hemos expresado ectopically subunidad NR1 del receptor NMDA etiquetada con proteína verde fluorescente en células embrionarias humanas (HEK293) como antígeno para detectar autoanticuerpos contra el receptor de NMDA en la sangre de pacientes con encefalitis autoinmune. Este sencillo método puede ser adecuado para la detección de propósitos en contextos clínicos.
Abstract
La presencia de anti-NMDA receptores autoanticuerpo puede causar diversos síntomas neuropsiquiátricos en los pacientes afectados, denominados encefalitis anti-NMDA autoinmune. Detección de los autoanticuerpos específicos contra el receptor NMDA en la sangre o líquido cefalorraquídeo (LCR) es esencial para la diagnosis exacta de esta condición. El receptor NMDA es un ion canal complejo de la proteína que contiene cuatro subunidades, incluyendo dos obligatorio NMDA receptor subunidad 1 (NR1) y uno o dos receptores NMDA 2A subunidad (NR2A), NMDA receptor la subunidad 2B (NR2B) subunidad del receptor NMDA 2C (NR2C), o del receptor NMDA subunidad 2D (NR2D). El epitopo del autoanticuerpo de anti-NMDA receptor se informó a estar presente en el dominio N-terminal extracelular de la subunidad NR1 del receptor NMDA. El objetivo de este estudio es desarrollar un análisis de la inmunofluorescencia celular simple que puede utilizarse como una prueba de cribado para detectar la presencia de autoanticuerpos contra la subunidad NR1 del receptor NMDA en la sangre para facilitar la investigación clínica y básica de encefalitis autoinmune anti-NMDA.
Introduction
Encefalitis anti-NMDA autoinmune es una entidad nuevamente reconocida de enfermedad que puede ocurrir en pacientes de todas las edades y afecta a pacientes predominantemente femenino1,2. Es una de la encefalitis más frecuentemente diagnosticada entre los pacientes con etiología desconocida inicial de encefalitis3. Los pacientes afectados con encefalitis anti-NMDA generalmente tienen síntomas prodrómicos de fiebre, seguida por el desarrollo rápido de cambio de nivel de conciencia y una variedad de síntomas neuropsiquiátricos agudos, como agitación, irritabilidad o dolor de cabeza , ataques de ansiedad, insomnio, alucinaciones, delirios, agresividad, comportamientos extraños, anormalidades de movimiento, dysregulation autonómico y asimiento4,5. Reconocimiento temprano de esta condición y el tratamiento oportuno con inmunoterapia son importantes para un mejor resultado y recuperación completa incluso en los pacientes afectados6. Por lo tanto, se sugiere que la encefalitis anti-NMDA autoinmune se debe considerar como un importante diagnóstico diferencial de pacientes que presentan con características psicóticas agudas o del nuevo-inicio7,8.
Además de las características clínicas, la detección de autoanticuerpos contra el receptor NMDA en la sangre o el CSF es esencial para la diagnosis exacta de anti-NMDA receptor encefalitis autoinmune9. La mayoría de las pruebas inmunológicas para detectar el autoanticuerpo del receptor anti-NMDA está disponible en algunos laboratorios de investigación10,11, y hay solamente un análisis de la inmunofluorescencia celular comercialmente disponibles para la detección del anti-NMDA receptores autoanticuerpos12. El objetivo de este estudio es desarrollar un análisis de la inmunofluorescencia de celular interna simple que puede ser utilizado convenientemente en el laboratorio para detectar la presencia de anti-NMDA receptores autoanticuerpos para facilitar la investigación clínica del receptor anti-NMDA encefalitis autoinmune. El receptor NMDA es un heterotetrámero ion canal complejo de la proteína expresado específicamente en el cerebro. Se hace de dos subunidades NR1 obligatorias y la combinación de una o dos subunidades de NR2A, NR2B, NR2C o NR2D13. Un estudio informó que el epitopo principal blanco de los anticuerpos fue en el dominio N-terminal extracelular de la subunidad NR1 del5. Por lo tanto, en este protocolo, expresa la proteína recombinante humana de la subunidad NR1 del receptor NMDA con proteína verde fluorescente (GFP) en la línea de células epiteliales de riñón embrionario humano (HEK293) la etiqueta de y desarrollar un análisis de la inmunofluorescencia basadas en células para detectar la clase IgG de autoanticuerpos del receptor de anti-NMDA en la sangre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios ensayos inmunológicos celulares para detectar la presencia de autoanticuerpos contra el receptor NMDA, divulgado en la literatura, incluyendo inmunofluorescencia celular vivo ensayo11, fijada de análisis de la inmunofluorescencia celular9 , y basados en la citometría de flujo ensayo14. El análisis de la inmunofluorescencia celular vivo debe realizarse poco después de la preparación de las células ectopically expresaban la proteína …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación médica de Chang Gung (número de licencia CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 y CMRPG3E0633).
Materials
| GRIN1 (GFP-tagged) – Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
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