Un semplice Cell-based immunofluorescenza per rilevare autoanticorpi contro il recettore N-metil-D-aspartato (NMDA) nel sangue
Summary
Abbiamo ectopically espresso NR1 subunità del recettore NMDA etichettato come proteina fluorescente verde in cellule embrionali umane (HEK293) come antigene per rilevare autoanticorpi diretti contro il recettore NMDA nel sangue di pazienti con sospettata con l’encefalite autoimmune. Questo semplice metodo può essere adatto per scopi nelle regolazioni cliniche di screening.
Abstract
La presenza degli autoanticorpi del recettore anti-NMDA può causare vari sintomi neuropsichiatrici in pazienti commoventi, definiti l’encefalite autoimmune di anti-NMDA receptor. L’individuazione degli specifici autoanticorpi contro il recettore NMDA nel sangue o liquido cerebrospinale (CSF) è essenziale per la diagnosi esatta di questa condizione. Il recettore NMDA è un complesso di proteine canale dello ione che contiene quattro subunità, tra cui due subunità di ricevitore NMDA 1 (NR1) obbligatoria e recettore NMDA uno o due subunità 2A (NR2A), 2B di subunità del recettore NMDA (NR2B), unità secondaria del ricevitore NMDA 2C (NR2C), o del recettore NMDA subunità 2D (NR2D). L’epitopo di autoanticorpi anti-NMDA del ricevitore è stato segnalato per essere presente nel dominio N-terminale extracellulare della subunità NR1 del recettore NMDA. L’obiettivo di questo studio è quello di sviluppare un test di immunofluorescenza basati su cellule semplice che può essere utilizzato come test di screening per rilevare la presenza di autoanticorpi diretti contro NR1 subunità del recettore NMDA nel sangue per facilitare la ricerca di base e clinica di encefalite autoimmune di anti-NMDA receptor.
Introduction
L’encefalite autoimmune di anti-NMDA del ricevitore è un’entità recentemente riconosciuta di malattia che può accadere in pazienti di tutte le età e colpisce i pazienti prevalentemente femminile1,2. È uno dell’encefalite più frequentemente diagnosticato fra i pazienti con eziologia sconosciuta iniziale di encefalite3. Pazienti affetti da encefalite di anti-NMDA receptor solitamente hanno sintomi prodromici di un mal di testa o febbre, seguita dallo sviluppo veloce del cambiamento di livello di coscienza e una varietà di sintomi neuropsichiatrici acuti, tra cui agitazione, irritabilità , ansia, insonnia, allucinazioni, deliri, aggressività, comportamenti bizzarri, anomalie del movimento, disregolazione autonomica e sequestro attacchi4,5. Il riconoscimento iniziale di questa condizione e il tempestivo trattamento con immunoterapia sono importanti per un risultato migliore e anche pieno recupero in pazienti colpiti6. Quindi, esso è suggerito che l’encefalite autoimmune di anti-NMDA del ricevitore dovrebbe essere considerata come un’importante diagnosi differenziale dei pazienti che presentano con caratteristiche psicotiche acute o nuova insorgenza7,8.
Oltre alle caratteristiche cliniche, rilevamento degli autoanticorpi contro il recettore NMDA nel sangue o CSF è essenziale per la diagnosi esatta di anti-NMDA receptor encefalite autoimmune9. La maggior parte dei test immunologici per rilevare il autoantibody del recettore anti-NMDA sono disponibile in qualche ricerca laboratori10,11, e c’è solo un test di immunofluorescenza di basati su cellule commercialmente disponibili per lo screening del anti-NMDA receptor autoantibodies12. L’obiettivo di questo studio è quello di sviluppare un test di immunofluorescenza di basati su cellule in-House semplice che può essere convenientemente utilizzato in laboratorio allo schermo anti-NMDA receptor autoanticorpi per facilitare la ricerca clinica del recettore NMDA anti encefalite autoimmune. Il recettore NMDA è una heterotetramer ione canale proteina complessa specificamente espressa nel cervello. È fatta di due unità secondarie NR1 obbligatorie e la combinazione di uno o due subunità NR2A, NR2B, NR2C o NR2D13. Un precedente studio riferito che l’epitopo principale mirato da parte degli anticorpi è presso il dominio N-terminale extracellulare della subunità NR15. Quindi, in questo protocollo, esprimiamo la proteina ricombinante umana di NR1-subunità del recettore NMDA etichettato come proteina fluorescente verde (GFP) nella linea cellulare epiteliale embrionali umane del rene (HEK293) e sviluppare un test di immunofluorescenza basati su cellule per rilevare la classe di IgG del anti-NMDA receptor autoanticorpi nel sangue.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono parecchi saggi immunologici basati su celle a schermo la presenza di autoanticorpi diretti contro il recettore NMDA segnalati nella letteratura, compreso immunofluorescenza diretta basati su cellule test11, fissata il test di immunofluorescenza basati su cellule9 , e14di analisi basati su citometria a flusso. Il test di immunofluorescenza diretta basati su cellule deve essere eseguito subito dopo la preparazione delle celle ectopically esprim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione medica Chang Gung (concessione numero CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 e CMRPG3E0633).
Materials
| GRIN1 (GFP-tagged) – Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
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