Eine einfache zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay, Autoantikörper gegen das N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren im Blut zu erkennen
Summary
Wir drückten ectopically NR1 Untereinheit der NMDA-Rezeptor mit dem Stichwort grünen fluoreszierenden Proteins in den menschlichen embryonalen Zellen (HEK293) als Antigen Autoantikörper gegen NMDA-Rezeptor im Blut von Patienten mit Verdacht mit autoimmune Enzephalitis zu erkennen. Diese einfache Methode möglicherweise zu screening-Zwecken in klinischen Umgebungen geeignet.
Abstract
Das Vorhandensein von Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper kann dazu führen, dass verschiedene neuropsychiatrische Symptome bei den betroffenen Patienten, Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis bezeichnet. Nachweis von spezifischen Autoantikörper gegen den NMDA-Rezeptor im Blut oder Liquor cerebrospinalis (CSF) ist wichtig für die genaue Diagnose dieser Erkrankung. Der NMDA-Rezeptor ist ein Ionen-Kanal Proteinkomplex, der vier Untereinheiten, einschließlich zwei obligatorische NMDA-Rezeptor Untereinheit 1 (NR1) und ein oder zwei NMDA-Rezeptor enthält Untereinheit 2A (NR2A), NMDA-Rezeptor-Untereinheit 2 b (NR2B), NMDA-Rezeptor-Untereinheit 2C (NR2C) oder NMDA-Rezeptor Untereinheit 2D (NR2D). Das Epitop des Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper wurde berichtet, dass in den extrazellulären N-terminale Domäne des NR1 Untereinheit des NMDA-Rezeptors anwesend sein. Das Ziel dieser Studie ist es, einen einfachen zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay zu entwickeln, der als Screening-Test zum Nachweis von Autoantikörpern gegen NR1 Untereinheit des NMDA-Rezeptors im Blut, die klinische und Forschung zu erleichtern verwendet werden kann Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis.
Introduction
Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis ist eine neu erkannten Krankheit-Einheit, die bei Patienten aller Altersgruppen auftreten kann, und betrifft überwiegend weiblichen Patienten1,2. Es ist eines der am häufigsten diagnostizierten Enzephalitis bei Patienten mit initial unbekannter Ätiologie der Enzephalitis3. Patienten, die mit Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis in der Regel haben prodromale Symptome von Kopfschmerzen oder Fieber, gefolgt durch die schnelle Entwicklung des Bewusstseins Ebene ändern und eine Vielzahl von akuten neuropsychiatrischen Symptome, wie Unruhe, Reizbarkeit , Angst, Schlaflosigkeit, Halluzinationen, Wahnvorstellungen, Aggression, bizarre Verhaltensweisen, Bewegungsstörungen, autonome Dysregulation und Beschlagnahme Angriffe4,5. Früherkennung von diesem Zustand und rechtzeitige Behandlung mit Immuntherapie sind wichtig für ein besseres Ergebnis und sogar vollständige Erholung der betroffenen Patienten6. Daher wird vorgeschlagen, dass Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis als eine wichtige Differentialdiagnose von Patienten mit akuten oder neue einsetzende psychotische Merkmale7,8betrachtet werden sollte.
Neben der klinischen Merkmale ist die Detektion von Autoantikörper gegen den NMDA-Rezeptor in Blut oder Liquor wesentlich für die genaue Diagnose der Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis9. Die meisten der immunologischen Tests zur Erkennung von Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper sind verfügbar in einigen Forschung Labors10,11, und es gibt nur einen handelsüblichen zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay für das Screening der Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper12. Das Ziel dieser Studie ist es, einen einfachen Inhouse zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay zu entwickeln, der bequem im Labor verwendet werden kann, das Vorhandensein von Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper, die klinische Forschung von Anti-NMDA-Rezeptor zu erleichtern den Bildschirm autoimmune Enzephalitis. Der NMDA-Rezeptor ist ein Heterotetramer Ionen-Kanal Proteinkomplex speziell im Gehirn ausgedrückt. Es besteht aus zwei obligatorischen NR1 Untereinheiten und die Kombination von ein oder zwei Untereinheiten NR2A, NR2B, NR2C oder NR2D13. Eine frühere Studie berichtet, dass die wichtigsten Epitop gezielt durch die Antikörper an den extrazellulären N-terminale Domäne des NR1 Untereinheit5. Daher in diesem Protokoll wir zum Ausdruck bringen des menschlichen Proteins für rekombinanten NR1-Untereinheit der NMDA-Rezeptor mit dem Stichwort grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) in den menschlichen embryonalen Niere epithelialen Zell-Linie (HEK293), und entwickeln eine zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay zu erkennen der IgG-Klasse der Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper im Blut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere zellbasierte immunologische Tests auf das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen NMDA-Rezeptor beschrieben, darunter live zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay11, zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay9 behoben , und Flow Cytometry-basierte assay14. Der live zellbasierte Immunfluoreszenz-Test sollte durchgeführt werden, kurz nach der Herstellung der Zellen das NR1-Protein, ectopically auszudrücken, während Flow Cytometry basierende As…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Chang Gung Medical Foundation (Grant-Nummer CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 und CMRPG3E0633) unterstützt.
Materials
| GRIN1 (GFP-tagged) – Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
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