Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Gen Funktionsanalyse umfasst in der Regel einen phänotypische Vergleich zwischen einem Wildtyp Stamm und einem Stamm, in dem ein bestimmtes Gen des Interesses gestört wurde. Diese gen-Störung-Technik ist für die Funktion von Genanalysen in einer Vielzahl von Taxa, von Bakterien bis zu den Säugetieren verwendet worden. Ein Gen-Störung-Konstrukt ist notwendig für die Generation des Stammes gen gestört; Dieses Konstrukt der Desoxyribonukleinsäure (DNA) besteht aus der Antibiotikaresistenz-Marker-gen mit den vor- und nachgelagerten flankierenden Regionen des Zielgens verschmolzen und ist integriert in das Genom durch homologe Rekombination. Die gen-gestört Belastung kann mithilfe von Selektivmedien mit dem Antibiotikum isoliert sein. Die konventionelle Methode verwendet für den Bau des Stammes gen gestört erfordert komplexe Arbeitsschritte, wie die Verstärkung des Zielgens durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Unterbindung des Gens in eine geeignete Plasmid, Verdauung mit Einschränkung Enzyme und Religation Antibiotikaresistenz-Marker-gen eingefügt. Dieser Prozess ist zeitaufwändig, die mehrere Tage bis zu mehreren Wochen, je nach Erfolg der einzelnen Schritte. Darüber hinaus ist das Design der Störung Konstrukte der Beschränkungsenzymsites des Zielgens abhängig. Um diese Probleme zu beheben, wurden DNA-PCR-basierter Spleißen Methoden^1,2 für die Gestaltung von gen gestört Mutanten von Dictyostelium Discoideum³ und Synechocystis SP. PCC6803⁴ gemeldet. In der vorliegenden Studie wurde eine Methode entwickelt, um ein Gen gestört Streptokokken Stamm in eine relativ schnelle, einfache und kostengünstige Art und Weise, unter Verwendung einer modifizierten PCR-basierten Methode (2-stufige Fusion PCR bezeichnet) für den Bau der Störung zu erzeugen Konstrukt und Electroporation für gentechnische Transformation.

Die 2-stufige Fusion benötigten PCR genomischer DNA, die Antibiotikaresistenz-Marker-gen als Kopiervorlage PCR und vier Paare von angemessen entworfen Oligonukleotid-Primer. Im ersten Schritt (1^St PCR), ein 1-kb upstream flankierenden Region des Zielgens, ein 1-kb downstream flankierenden Region des Ziels werden gen und Antibiotikaresistenz-Marker-gen mittels PCR amplifiziert. Die 5′ Regionen der rückwärts-Primer und die forward Primer für Verstärkung von den vorgelagerten und nachgelagerten flankierenden Regionen, bzw. gehören 15 Basen komplementär zu den Enden des Markergens. Die 5′ Regionen von forward und reverse Primer für Marker-gen-Amplifikation gehören ebenso 15 Basen komplementär zu der unteren Ende der vorgelagerten flankierenden Region des Zielgens und das obere Ende der nachgeschalteten flankierenden Region des Zielgens, bzw.. Daher enthalten die drei amplifizierten Fragmente überlappende 30 Basenpaare Regionen auf dem Fusion-Gelände. Im zweiten Schritt (2^Nd PCR) ist die PCR mit verschachtelten PCR Primer verwenden die drei Fragmente, die durch die 1^St PCR als Vorlagen verstärkt durchgeführt. Die komplementäre Regionen der Vorlagen sind zusätzlich über 2^Nd PCR miteinander verbunden. Zu guter Letzt wird das Konstrukt für homologe Rekombination der Wildtyp Stamm durch Elektroporation vorgestellt. Erfolgreiche gen Störung kann durch PCR mit spezifischen Primern verifiziert werden. Obwohl die Störung Konstrukt mit High-Fidelity-DNA-Polymerase verstärkt ist, sind zusätzliche enzymatische Reaktionen, wie DNA-Ligatur oder DNA-Verdauung, nicht notwendig, um das Konstrukt zu erzeugen. Darüber hinaus kann eine gelöschte oder erhaltene Region über das Genom nach besser gekleideteres Design flexibel gewählt werden.

In der vorliegenden Arbeit erfolgte Löschung der gesamten kodierenden Region des Gens GtfC , die Glucosyltransferase in Streptococcus Mutanskodiert, um die schnelle, einfache gen Störung Methode in einer Streptokokken-Spezies zu demonstrieren. Darüber hinaus eine GtfB-gestörten Belastung wurde auf die gleiche Weise erzeugt. Die Glucosyltransferases von GtfC und GtfB kodiert tragen zur kariogenen dentale Biofilm Entwicklung^5,6. Die Bildung von Biofilm Fähigkeiten der Wildtyp-Stamm (S. Mutans WT), GtfC-Dehnung (S. Mutans ΔGtfC) und GtfBgestört-gestörten Belastung (S. Mutans ΔGtfB) wurden ausgewertet für vergleichende phänotypische Analysen. Dieses Protokoll erweitert die Anwendung eines zweistufigen Verfahrens zur gen Störung einer zusätzlichen Arten und für Studien der Genfunktion in einem breiteren Spektrum von Taxa geändert werden kann.