Generación de un gen interrumpido Streptococcus mutans cepa sin gen clonación

Análisis de la función génica implica típicamente una comparación fenotípica entre una cepa de tipo salvaje y una cepa en la que un determinado gen de interés se ha visto alterado. Esta técnica de interrupción génica se ha utilizado para el análisis de la función del gene en una amplia gama de especies, desde bacterias hasta mamíferos. Un constructo gene-interrupción es necesario para la generación de la cepa gen interrumpido; Esta construcción de ácido desoxirribonucleico (ADN) consiste en el gen marcador de resistencia a los antibióticos sobre el upstream y downstream flanqueando las regiones del gen blanco y se incorpora en el genoma por recombinación homóloga. La cepa gen interrumpido puede ser aislada usando medios selectivos que contienen el antibiótico. El método convencional utilizado para la construcción de la cepa gen interrumpido requiere medidas complejas, como la amplificación del gen por reacción en cadena de polimerasa (PCR), la ligadura del gen en un plásmido adecuado, digestión con restricción de destino enzimas y religación para insertar el gen marcador de resistencia a antibióticos. Este proceso es lento, tomando varios días a varias semanas, dependiendo el éxito de cada paso. Además, el diseño de construcciones de la interrupción depende de los sitios de la enzima de la restricción del gene blanco. Para resolver estos problemas, se han reportado DNA Polimerización en cadena-basado que empalma métodos^1,2 para el diseño de mutantes gene-disrupted de Dictyostelium discoideum³ y Synechocystis SP. PCC6803⁴ . En el presente estudio, se desarrolló un método para generar una cepa estreptocócica gen interrumpido de una manera relativamente rápida, fácil y de bajo costo, utilizando un método modificado basado en PCR (señalado paso 2 fusión PCR) para la construcción de la interrupción construcción y electroporación para transformación genética.

La fusión de 2-step que PCR requiere de ADN genómico, el gen marcador de resistencia a los antibióticos como una plantilla PCR y cuatro pares de apropiadamente diseñado cartillas del oligonucleótido. En el primer paso (1^st de PCR), una región que flanqueaba aguas arriba de 1 kb del gene del destino, una región que flanqueaba aguas abajo de 1 kb del objetivo gen y el gen marcador de resistencia a antibióticos se amplifican por PCR. Las regiones 5′ de la cartilla reversa y la cartilla hacia adelante, para la amplificación de la aguas arriba y aguas abajo que flanquean regiones, respectivamente, incluyen 15 bases complementarios a los extremos del gen marcador. Las 5′ regiones de avance y retroceso primers para la amplificación del gen marcador igualmente incluyen 15 bases complementarias a la parte inferior de la región que flanqueaba por aguas arriba de la gene de la blanco y el extremo superior de la región que flanqueaba corriente abajo del gen blanco, respectivamente. Por lo tanto, los tres fragmentos amplificados contienen regiones de 30-pares superpuestos en el sitio de fusión. En el segundo paso (2^nd PCR), PCR se realiza con las cartillas PCR anidadas utilizando los tres fragmentos amplificados por la 1^st PCR como plantillas. Las regiones complementarias de las plantillas están además vinculadas entre sí a través de la 2^nd PCR. Por último, la construcción para la recombinación homóloga es introducida a la cepa de tipo salvaje por electroporación. Interrupción génica exitosa puede ser verificada por PCR usando las cartillas específicas. Aunque el concepto de interrupción se amplifica utilizando la DNA polimerasa de alta fidelidad, reacciones enzimáticas adicionales, tales como la ligadura de la DNA o digestión de DNA, no son necesarias para generar la construcción. Además, una región eliminada o conservada en el genoma puede ser elegida fexiblemente según primer diseño.

En el presente trabajo, canceladura de la región entera de la codificación del gene gtfC , que codifica la glucosiltransferasa de Streptococcus mutans, se realizó para demostrar el método de interrupción del gene rápido, fácil en una especie estreptocócica. Además, un gtfB-alteración de la tensión se generó de la misma manera. Glucosiltransferasas codificados por gtfB y gtfC contribuyen a cariogénicas biofilm dental desarrollo^5,6. Las capacidades de formación de biofilm del tipo tensión (S. mutans WT), gtfC-interrumpió cepa (S. mutans ΔgtfC) y gtfB-tensión interrumpida (S. mutans ΔgtfB) se evaluaron análisis fenotípico comparativo. Este protocolo extiende la aplicación de un método de dos etapas para la interrupción del gene de una especie adicional y puede ser modificado para los estudios de función del gen en una amplia gama de taxa.