Generazione di un Gene-interrotto lo streptococco mutans Strain senza clonaggio genico

Analisi di funzione del gene in genere implica un confronto fenotipico tra un ceppo selvaggio-tipo e un ceppo in cui è stato interrotto un particolare gene di interesse. Questa tecnica di rottura del gene è stata utilizzata per analisi di funzione del gene in una vasta gamma di taxa, dai batteri ai mammiferi. Un costrutto di rottura del gene è necessario per la generazione del ceppo gene-interrotto; Questo costrutto di acido desossiribonucleico (DNA) consiste del gene marcatore di resistenza agli antibiotici fuso a Monte e a valle delle regioni fiancheggianti del gene target ed è incorporato il genoma tramite ricombinazione omologa. Il ceppo di gene-interrotto può essere isolato utilizzando terreni selettivi che contengono l’antibiotico. Il metodo convenzionale utilizzato per la costruzione del ceppo gene-interrotto richiede operazioni complesse, quali l’amplificazione del gene target da reazione a catena della polimerasi (PCR), legatura del gene in un plasmide adatto, digestione con restrizione enzimi e religation per inserire il gene marcatore di resistenza agli antibiotici. Questo processo è che richiede tempo, prendendo diversi giorni a diverse settimane, a seconda dell’esito di ogni passo. Inoltre, il design dei costrutti di rottura è dipenda sui siti degli enzimi di limitazione del gene target. Per risolvere questi problemi, sono stati segnalati basati su PCR del DNA metodi d’impionbatura^{2 1,}per la progettazione di gene-perturbato mutanti di Dictyostelium discoideum³ e Synechocystis SP. PCC6803⁴ . Nello studio presente, è stato sviluppato un metodo per generare un ceppo streptococcico gene-interrotto in maniera relativamente rapida, facile e poco costoso, che utilizza un metodo basato su PCR modificato (designato fusione 2-step PCR) per la costruzione della perturbazione costrutto ed elettroporazione per trasformazione genetica.

La fusione di 2-step che PCR richiede DNA genomic, gene marcatore di resistenza agli antibiotici come un modello PCR e quattro coppie di opportunamente progettato gli iniettori del oligonucleotide. Nella prima fase (1^st PCR), una regione di accompagnamento 1 kb a Monte del gene target, una regione di fiancheggiamento 1 kb a valle della destinazione gene e gene marcatore di resistenza agli antibiotici sono amplificati mediante PCR. Regioni 5′ sia il primer reverse e il primer in avanti, per l’amplificazione della a Monte e a valle delle regioni, fiancheggianti rispettivamente, includono 15 basi complementari fino agli estremi confini del gene marcatore. 5′ regioni di sia forward e reverse primer per l’amplificazione del gene marcatore Analogamente includono 15 basi complementari all’estremità inferiore della regione di fiancheggiamento a Monte del gene dell’obiettivo e l’estremità superiore della regione di fiancheggiamento a valle del gene target, rispettivamente. Di conseguenza, i tre frammenti amplificati contengono regioni sovrapposte di coppia 30-base presso il sito di fusione. Nella seconda fase (2^nd PCR), PCR viene eseguita con gli iniettori PCR annidati utilizzando i tre frammenti amplificati da 1^st PCR come modelli. Le regioni complementari dei modelli sono inoltre collegate tra loro tramite la 2^nd PCR. Infine, il costrutto per ricombinazione omologa è stato introdotto al ceppo selvaggio-tipo di elettroporazione. Successo del gene può essere verificato mediante PCR utilizzando primers specifici. Anche se il costrutto di rottura è amplificato utilizzando ad alta fedeltà della polimerasi del DNA, ulteriori reazioni enzimatiche, come la legatura del DNA o digestione del DNA, non sono necessari per generare il costrutto. Inoltre, una regione eliminata o conservata sul genoma può essere scelti in modo flessibile secondo il disegno dell’iniettore.

Nel presente lavoro, l’eliminazione di intera regione di codificazione del gene gtfC , che codifica glucosiltransferasi in Streptococcus mutans, è stata eseguita per illustrare il metodo di rottura rapida, facile gene in una specie streptococciche. Inoltre, un gtfB-ceppo interrotta è stato generato nello stesso modo. Il glucosyltransferases codificati da sia gtfC e gtfB contribuiscono a cariogeni biofilm dentale sviluppo^5,6. Le abilità che formano biofilm del selvaggio-tipo di ceppo (S. mutans WT), gtfC-interrotto ceppo (S. mutans ΔgtfC) e gtfB-ceppo perturbato (S. mutans ΔgtfB) sono stati valutati per analisi fenotipiche comparative. Questo protocollo si estende l’applicazione di un metodo in due fasi per rottura del gene ad un’altre specie e può essere modificato per gli studi di funzione del gene in una gamma più ampia di taxa.