Summary

İmünohistokimya ve Akım Sitometri Kullanımı Endobronşiyal Biyopsilerinde Mekansal Dağılımı ve Fenotipik Kimlik: İnsan Akciğer dendritik hücrelerin

Published: January 20, 2017
doi:

Summary

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Abstract

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Introduction

Akciğerler dış çevre ile sürekli temas halindeyiz ve çok hastalığa neden kapasitesine sahip hem zararsız parçacıkların ve mikropların maruz kalmaktadır. Bu nedenle, işgalci patojenlere karşı güçlü bir bağışıklık tepkisini monte bağışıklık sistemi için çok önemlidir, ancak hastalığa neden olmayan inhale edilen antijenler tolerans sağlamak için eşit derecede önemlidir. güçlü bir bağışıklık gözetim sağlamak için, solunum sistemi, dendritik hücreler (DC) da dahil olmak üzere bağışıklık hücreleri, bir ağ ile astarlanmıştır. DH'ler naif T hücrelerini aktive etmek özgü kapasiteli profesyonel antijen sunan hücrelerdir. İnsan akciğerlerde, yerleşik DH'ler bir antijen ve sonra işlemi karşılaşırsanız ve T hücreleri 1, 2, 3 tanıtımı ve aktivasyonu için akciğer lenf düğümlerine taşıyın.

insan bağışıklık sisteminde, DCler Distin ile birkaç alt takımından ayrılabilirct ama örtüşen fonksiyonları: CD1c + ve CD141 + miyeloid DH'ler (MDC) ve CD123 + plazmositoid DC'ler (PDC) 4, 5. Insan DC'lerde en detaylı bilgi kanda çalışmalardan kaynaklanıyor olsa da, insan akciğerleri de T-hücre uyarıcı kapasitesi 6, 7, 8, 9 DC alt gruplarının nadir popülasyonları liman artık açıktır. Ancak, biriken veri DC'lere dahil bağışıklık hücreleri, onların anatomik konumu 10 bağlı frekans, fenotip ve fonksiyon açısından farklılık göstermektedir. Nedenle, yerel bağışıklık ve hoşgörü katkılarını anlamak için, ilgili dokudan bağışıklık hücrelerini incelemek için önemlidir. Birlikte ele alındığında, bu kan DC'ler daha kolay kullanılabilir ve erişilebilir olmasına rağmen, akciğer hastalıkları ele alırken akciğer yerleşik DC'ler incelemek gerektiğinin altını çizen İnsanlarda.

Insanlarda akciğer yerleşik DH'lerin inceleyen ilk çalışmalar öncelikle immünohistokimya 11, 12, 13 kullanılarak doku kesitlerinde, morfoloji ve HLA-DR ve CD11c'nin olarak tek belirteçler, ifadesi dayanmıştır. Buna karşılık, genellikle akış sitometrik dayanıyordu daha yeni çalışmalar, farklı immün hücre alt grupları incelemek için analiz eder. bu benzersiz belirli bir DC alt kümesini tanımlayan tek bir hücre-yüzey işaretleyici bulmak zor olduğundan Ancak, çalışmaların potansiyel sınırlama sadece dört renkli akım sitometri uygulayarak DC'ler benzer fenotipik işaretleri ile hücre popülasyonlarının dahil riskidir. Örneğin, CD11c, tüm miyeloid DC'lerin ve monositlerin büyük çoğunluğu üzerinde ifade edilir. Öte yandan, çalışmalarda daha ileri akış sitometri panelleri uygulanması, hastanın cerrahi rezeksiyon ile ilgili kanserli olmayan akciğer dokusu tipik olarak kullanılanxref "> 10, 14, 15, 16, nadir popülasyonları sağlıklı kişilerde DC'ler mevcut gerçekten temsilcisi olmadığı belirsizdir rağmen. Genel olarak, çalışmalar nedeniyle cerrahi olarak çıkarılırlar veya tüm insan akciğer dokusu kıt olmasından büyük ölçüde sınırlıdır.

Bu sınırlamalar bazılarının üstesinden gelmek için, bu iş mekansal dağılımı ve bronkoskopi geçmesi sağlıklı gönüllülerden elde edilen mukozal endobronşiyal biyopsi DC'lerin bir fenotipik tanımlama ayrıntılı bir analizini gerçekleştirmek açıklamaktadır. Birkaç küçük biyopsiler her birey alınabilir ve daha sonra kesit ve analiz gelişmiş akım sitometri analizi için sindirilmiş enzimatik immünhistokimya veya kullanmak için gömülü olabilir. bronkoskopi elde endobronfliyal biyopsi şeklinde akciğer dokusu kullanılarak mümkün st gerçekleştirmek için yapma avantajı kazandıranudy sağlıklı gönüllü üzerinde, akciğer açık cerrahi aksine bilinen nedenlerle, göğüs cerrahi gerektiren hastalar ile sınırlıdır, o. Ayrıca, sağlıklı gönüllülerden bir bronkoskopi sırasında örneklenir doku akciğer hastalığı olan hastalarda akciğer dokusunda olmayan bir etkilenen bölgeye aksine, fizyolojik olarak normaldir. Öte yandan, biyopsiler, küçük ve birden fazla biyopsileri havuzu da alınan hücrelerin sayısı, gerçekleştirilebilir analizlerin sınırlar.

Bu çalışma DC'ler odaklanırken, doğrudan genişletilebilir açıklanan yöntemler, insan mukozal akciğer dokusunda bulunan diğer ilgi (bağışıklık) hücreleri dahil etmek. Ayrıca, protokoller aynı zamanda bronkoskopi, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), sarkoidoz, ya da akciğer kanseri gibi tanı oluşturulması parçası olan pulmoner hastalıklardan muzdarip hastalardan elde edilen örneklerde için direkt olarak uygulanabilir.

Protocol

Not: Bu araştırma Umea, İsveç'te bölgesel Etik Değerlendirme Kurulu tarafından onaylandı. İnsan Deneklerin Örnekleme Endobronşiyal Biyopsilerinde 1. Bronkoskopi Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onam edinin. Oral midazolam (4-8 mg) ve intravenöz glikopirronyum (0,2-04 mg) bronkoskopi önce 30 dk konuları davranın. gırtlak ve bronşlarda lidokain topikal anestezi uygulayın. lidokain% 4 ~ 3 ml konu gargara edelim ve dil kökünde ve bir gırtlak…

Representative Results

DC'lere dahil olmak üzere insan solunum doku yerleşik bağışıklık hücrelerini, karakterize Çalışmalar, büyük oranda cerrahi olarak çıkarılırlar veya tüm insan akciğer dokusu kıt olması nedeniyle sınırlıdır. Burada, sitometri immünhistokimya kullanarak dokuda bağışıklık hücreleri incelemek veya akış sağlıklı gönüllülerde ve gelişmiş protokollerin endobronşiyal biyopsi (EBB) akciğer dokusunu elde etme az invazif bir yöntem özetlenmiştir. </…

Discussion

Bu kağıt immünohistokimya kullanılarak sağlıklı insanlarda akciğer dokusu yerleşik DC'lerin detaylı mekansal ve fenotipik karakterizasyonu üretmek ve bronkoskopi sırasında toplanan endobronşiyal mukozal biyopsi üzerinde flow sitometri açıklamaktadır. Aşağıdaki paragraflarda protokol kritik adımlar ayrıntılı olarak ele alınmaktadır.

Protokol Kritik adımlar

Kesit ve immünhistokimya: Onlara (adım 2.5) kullanmadığınız zamanlarda -20…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, bu çalışmanın klinik malzeme katkıda bulunan gönüllülere teşekkür etmek istiyorum. Biz de tüm klinik materyalin toplanması için Halk Sağlığı ve Klinik Tıp, Tıp / Solunum Hastalıkları Bölümü, Üniversite Hastanesi, Umea (Norrlands universitetssjukhus) Bölümü personeline teşekkür ediyoruz.

Bu çalışma İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Kalp-Akciğer Vakfı, Stratejik Araştırmalar İsveç Vakfı ve Karolinska Enstitüsünde AS-S hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160 Olympus BF1T160
Light source  Olympus Exera CV-160
Fenestrated forceps Olympus FB21C Used to take biopsies
Bite Block Conmed 1429 20x27mm
Glucose 25%  500mL intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40mg/mL Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100mg/ml spray Administered to back of throat
Lidocaine 20mg/ml spray Administered via bronchoscope to airways
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA processing and embedding
Glass vials 5mL
Acetone Sigma-Aldrich 32201-1L
Molecular sieves, 4A Alfa Aesar 88120 3-4mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P-7626 0.035g/100ml acetone
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I-6125 0.37g/100ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules TAAB laboratories C094 x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder TAAB laboratories C054 Holds 25 8mm capsules
JB-4 GMA embedding kit Polysciences 00226 Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate Sigma-Aldrich 27614-1L
Silica gel with humidity indicator Scharlau GE0043 2.5-6mm 
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA sectioning
Glass microscope slides ThermoFisher Scientific 10143562CEF Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution Sigma-Aldrich P8920-500mL 1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy Alkar
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287 Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker LKB
Capsule splitter TAAB laboratories C065
Carbon steel single edge blades TAAB laboratories B054
Vice
Ammonia, 25% VWR 1133.1000 2mL in 1L, 1:500 (0.05%)
Microtome Leica Leica RM 2165
Light source Leica Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand Leica Leica MZ6
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen Histolab 5218
Hydrogen peroxide 30% solution AnalaR Normapur 23619.264
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032
Tris Roche 10708976001
Sodium chloride VWR chemicals 27810.295
Bovine serum albumin Millipore 82-045-2 Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5546
Anti-human CD45 antibody BioLegend 304002 Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody AbD Serotech MCA80GA Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control Abcam ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control Dako X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit Vector Labs PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite Vector Labs SK-4200
Mayers haematoxylin HistoLab 01820
Permanent Aqueous Mounting Medium AbD Serotech BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution  VWR 360292F
Light microscope Leica Leica DMLB
Microscope camera Leica Leica DFC 320
Analysis software Leica Leica Qwin V3
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich 55021C
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
Collagenase II Sigma-Aldrich C6885
DNase Sigma-Aldrich 10104159001 ROCHE
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Forceps
Platform rocker Grant instruments PMR-30
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22
40 µm cell strainer Falcon 352340
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit Life Technologies L34957
CD45 BD 555485
CD3 BD 557757
CD20 BD 335829
CD56 Biolegend 318332
CD66abce Miltenyi 130-101-132
HLA-DR BD 555813
CD14 BD 557831
CD16 Biolegend 302026
CD11c BD 560369
CD1c Miltenyi 130-098-009
CD141 Miltenyi 130-090-514
CD103 Biolegend 350212
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775
LSR II Flow cytometer BD Flow cytometer
FlowJo FlowJo Software for analysis

References

  1. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  2. Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
  3. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
  4. Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
  5. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
  6. Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
  7. Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
  8. Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
  9. Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
  10. Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
  11. Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
  12. Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
  13. van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
  14. Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
  15. Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
  16. Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
  17. Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
  18. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  19. Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
  20. Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
  21. Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
  22. Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).

Play Video

Cite This Article
Baharom, F., Rankin, G., Scholz, S., Pourazar, J., Ahlm, C., Blomberg, A., Smed-Sörensen, A. Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (119), e55222, doi:10.3791/55222 (2017).

View Video