Summary

免疫組織化学およびフローサイトメトリーを用いた気管支生検における空間分布と表現型の同定:ヒト肺樹状細胞

Published: January 20, 2017
doi:

Summary

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Abstract

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Introduction

肺は、外部環境と連続的に接触している、高度に疾患を引き起こす能力を有する無害な粒子および微生物の両方にさらされています。したがって、侵入する病原体に対する強力な免疫応答をマウントする免疫システムにとって重要であるが、病気を引き起こさない吸入抗原に対する寛容を維持することも同様に重要です。強力な免疫監視機構を提供するために、呼吸器系は、樹状細胞(DC)を含む免疫細胞のネットワークが並んでいます。 DCは、ナイーブT細胞を活性化する固有の能力を有するプロフェッショナル抗原提示細胞です。ヒトの肺において、常駐DCを抗原と、処理が発生し、T細胞を1、2、3に提示および活性化のために肺流入領域リンパ節に輸送します。

ヒト免疫系では、DCはdistinで、複数のサブセットに分割することができCTが、重複する機能:CD1c +およびCD141 +骨髄性樹状細胞(MDCの)とCD123 +形質樹状細胞(PDCに)4、5。ヒトDC上で最も詳細な知識は、血液中の研究に由来するが、人間の肺はまた、T細胞刺激能6、7、8、9でDCサブセットの希少集団を保有することは現在明らかです。しかし、蓄積したデータは、DCなどの免疫細胞は、その解剖学的位置10に応じてその頻度、表現型、および機能が異なることを示しています。したがって、局所免疫と寛容への貢献を理解するために、関連する組織から免疫細胞を研究することが重要です。まとめると、これは、血液DCは、より容易に入手可能であり、アクセス可能であるにもかかわらず、肺疾患に対処するとき、肺常駐DCを検討する必要性を強調します人間インチ

ヒトにおける肺常駐DCを調べた最初の研究は、主に免疫組織化学11、12、13用いて組織切片において、形態や、HLA-DRおよびCD11cのような単一のマーカーの発現に依存していました。対照的に、典型的には、フローサイトメトリーに依存していたより最近の研究は、異なる免疫細胞サブセットを研究するために分析します。それは一意に特定のDCサブセットを識別する単一細胞表面マーカーを見出すことは困難であるので、わずか4色フローサイトメトリーを適用した研究の潜在的な制限は、DCと同様の表現型マーカーを有する細胞集団を含む、危険です。例えば、CD11cのすべての骨髄性DCおよび単球の大半で発現されます。一方、より高度なフローサイトメトリーパネルを適用する研究において、患者の外科的切除からの非癌性肺組織は、典型的に使用されました外部参照"> 10、14、15、16、これらの稀な集団が真に健康な被験者でのDCの存在の代表的なものであるかどうかは不明ですが。全体的には、研究は主として外科的に除去または全ヒト肺組織が不足しているという事実に制限されています。

これらの制限のいくつかを克服するために、この作品は空間分布と気管支鏡検査を受ける健康なボランティアから得た粘膜気管支生検におけるDCの表現型の識別の詳細な分析を実行する方法について説明します。いくつかの小さな生検を、各個体から採取することができ、その後、免疫組織化学を使用して切片化し、分析のために埋め込まれた、または酵素的に高度なフローサイトメトリー分析のために消化することができます。 bronchoscopiesから得られた気管支生検の形で肺組織を使用して、STを実行することを可能にするという利点を与えますUDYは、健康なボランティアに、肺の開放手術とは異なり、明らかな理由のために、胸部外科手術を必要とする患者に限定されている、ということ。さらに、健康なボランティアの気管支鏡検査の間にサンプリングされた組織は、肺疾患を有する患者における肺組織の非患部とは対照的に、生理的に正常です。一方、生検が小さく、いくつかの生検をプールさえ取得細胞の数は、実行することができる分析のタイプを制限します。

本研究は、樹状細胞に焦点を当てているが、記載された方法は、直接人間の粘膜肺組織に存在する関心のある他の(免疫)細胞を含むように拡張することができます。さらに、プロトコルはまた、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、サルコイドーシス、または肺癌のような気管支鏡検査は、診断を確立するための部分である肺疾患、に罹患した患者から得られた試​​料に直接適用可能です。

Protocol

注:この研究は、ウメオ、スウェーデンの地方倫理委員会によって承認されました。 ヒト対象から採取気管支生検1.気管支鏡検査すべての参加者からインフォームドコンセントを取得します。 気管支鏡検査の前に経口ミダゾラム(4-8 mg)を静脈内グリコピロニウム(0.2から04 mg)を30分で対象を治療。喉頭および気管支におけるリドカインで局所麻酔を適用…

Representative Results

DCを含むヒト呼吸組織常駐免疫細胞を特徴づける研究は、主として外科的に除去または全ヒト肺組織が不足しているという事実のために、限られています。ここでは、フローサイトメトリー、免疫組織化学を使用して組織内の免疫細胞を研究するか、流れるように健康なボランティアと開発されたプロトコルの気管支生検(EBB)から肺組織を得るためのより侵襲性の?…

Discussion

本稿では、免疫組織化学を使用して、健康なヒトにおける肺組織常駐DCの詳細な空間と表現型の特徴付けを生成し、気管支鏡検査中に収集された気管支粘膜生検でフローサイトメトリーする方法について説明します。以下の段落では、プロトコルにおける重要なステップは、詳細に説明します。

議定書の重要なステップ

セクショニングおよび免疫組織?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、この研究に臨床材料を貢献したボランティアに感謝したいと思います。我々はまた、すべての臨床材料の収集のための公衆衛生・臨床医学/呼吸器内科の部門、大学病院、ウメオ(Norrlandsのuniversitetssjukhus)の部門のスタッフに感謝しています。

この作品は、スウェーデンの研究評議会、スウェーデン心肺財団、戦略研究のためのスウェーデンの財団、カロリンスカ研究所からAS-Sへの助成金によってサポートされていました。

Materials

Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160 Olympus BF1T160
Light source  Olympus Exera CV-160
Fenestrated forceps Olympus FB21C Used to take biopsies
Bite Block Conmed 1429 20x27mm
Glucose 25%  500mL intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40mg/mL Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100mg/ml spray Administered to back of throat
Lidocaine 20mg/ml spray Administered via bronchoscope to airways
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA processing and embedding
Glass vials 5mL
Acetone Sigma-Aldrich 32201-1L
Molecular sieves, 4A Alfa Aesar 88120 3-4mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P-7626 0.035g/100ml acetone
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I-6125 0.37g/100ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules TAAB laboratories C094 x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder TAAB laboratories C054 Holds 25 8mm capsules
JB-4 GMA embedding kit Polysciences 00226 Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate Sigma-Aldrich 27614-1L
Silica gel with humidity indicator Scharlau GE0043 2.5-6mm 
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA sectioning
Glass microscope slides ThermoFisher Scientific 10143562CEF Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution Sigma-Aldrich P8920-500mL 1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy Alkar
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287 Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker LKB
Capsule splitter TAAB laboratories C065
Carbon steel single edge blades TAAB laboratories B054
Vice
Ammonia, 25% VWR 1133.1000 2mL in 1L, 1:500 (0.05%)
Microtome Leica Leica RM 2165
Light source Leica Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand Leica Leica MZ6
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen Histolab 5218
Hydrogen peroxide 30% solution AnalaR Normapur 23619.264
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032
Tris Roche 10708976001
Sodium chloride VWR chemicals 27810.295
Bovine serum albumin Millipore 82-045-2 Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5546
Anti-human CD45 antibody BioLegend 304002 Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody AbD Serotech MCA80GA Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control Abcam ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control Dako X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit Vector Labs PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite Vector Labs SK-4200
Mayers haematoxylin HistoLab 01820
Permanent Aqueous Mounting Medium AbD Serotech BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution  VWR 360292F
Light microscope Leica Leica DMLB
Microscope camera Leica Leica DFC 320
Analysis software Leica Leica Qwin V3
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich 55021C
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
Collagenase II Sigma-Aldrich C6885
DNase Sigma-Aldrich 10104159001 ROCHE
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Forceps
Platform rocker Grant instruments PMR-30
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22
40 µm cell strainer Falcon 352340
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit Life Technologies L34957
CD45 BD 555485
CD3 BD 557757
CD20 BD 335829
CD56 Biolegend 318332
CD66abce Miltenyi 130-101-132
HLA-DR BD 555813
CD14 BD 557831
CD16 Biolegend 302026
CD11c BD 560369
CD1c Miltenyi 130-098-009
CD141 Miltenyi 130-090-514
CD103 Biolegend 350212
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775
LSR II Flow cytometer BD Flow cytometer
FlowJo FlowJo Software for analysis

References

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Baharom, F., Rankin, G., Scholz, S., Pourazar, J., Ahlm, C., Blomberg, A., Smed-Sörensen, A. Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (119), e55222, doi:10.3791/55222 (2017).

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