Summary

Human Cells Lung dendritiques: Répartition spatiale et phénotypique identification dans endobronchique Biopsies par immunohistochimie et cytométrie de flux

Published: January 20, 2017
doi:

Summary

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Abstract

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Introduction

Les poumons sont en contact permanent avec l'environnement extérieur et sont très exposés à la fois des particules et des microbes inoffensifs ayant la capacité de provoquer une maladie. Par conséquent, il est essentiel pour le système immunitaire pour monter des réponses immunitaires puissantes contre les pathogènes envahissants, mais il est tout aussi important de maintenir la tolérance aux antigènes inhalés qui ne provoquent pas de maladie. Pour assurer la surveillance immunitaire puissante, le système respiratoire est garni d'un réseau de cellules du système immunitaire, notamment des cellules dendritiques (CD). DC sont des cellules présentatrices d'antigène professionnelles avec la capacité unique d'activer les cellules T naïves. Dans les poumons humains, les DC résidents rencontrent un antigène et ensuite traiter et de le transporter vers les ganglions lymphatiques drainant des poumons pour la présentation et à l' activation des cellules T 1, 2, 3.

Dans le système immunitaire humain, les DC peuvent être divisés en plusieurs sous-ensembles, avec distinct , mais qui se chevauchent fonctions: CD1c + et CD141 + DC myéloïdes (MDC) et CD123 + DC plasmacytoïdes (PDC) 4, 5. Alors que la plupart des connaissances détaillées sur les DC humaine provient des études dans le sang, il est maintenant évident que les poumons humains abritent aussi des populations rares de sous – ensembles DC avec des cellules T capacité stimulatrice 6, 7, 8, 9. Cependant, les données montrent que l' accumulation des cellules immunitaires, y compris les DC, diffèrent par leur fréquence, leur phénotype et la fonction en fonction de leur emplacement anatomique 10. Ainsi, il est important d'étudier les cellules du système immunitaire du tissu pertinent pour comprendre leur contribution à l'immunité locale et la tolérance. Pris ensemble, ce qui souligne la nécessité d'étudier les PED pulmonaires résident lorsque lutter contre les maladies pulmonaires, malgré les PED sanguins étant plus facilement disponibles et accessibles chez l'homme.

Les premières études qui a enquêté sur les PED pulmonaires résident chez l' homme sont principalement fondés sur la morphologie et l'expression de marqueurs simples, tels que HLA-DR et CD11c, dans des coupes de tissus par immunohistochimie 11, 12, 13. En revanche, des études plus récentes ont généralement compté sur cytométrie de flux des analyses pour étudier les différents sous-ensembles de cellules immunitaires. Cependant, étant donné qu'il est difficile de trouver un seul marqueur de surface cellulaire qui identifie uniquement un sous-ensemble spécifique DC, la limitation potentielle des études qu'appliquer quatre couleurs cytométrie en flux est le risque d'inclure des populations de cellules avec des marqueurs phénotypiques semblables à DC. Par exemple, CD11c est exprimée sur tous les DC myéloïdes et la grande majorité des monocytes. D'autre part, dans les études appliquant plus avancées panneaux de cytométrie de flux, les tissus pulmonaires non cancéreuses de résections chirurgicales de patients ont été généralement utiliséxref "> 10, 14, 15, 16, même si on ne sait pas si ces populations rares sont vraiment représentatives des PED présents chez des sujets sains. Dans l' ensemble, les études sont limitées en grande partie due au fait que chirurgicalement enlevé ou tissu entier de poumon humain est rare.

Pour surmonter certaines de ces limitations, cet ouvrage décrit comment effectuer une analyse détaillée de la distribution spatiale et une identification phénotypique des CD dans les biopsies bronchiques muqueuses obtenues chez des volontaires sains qui subissent une bronchoscopie. Plusieurs petites biopsies peuvent être collectées à partir de chaque individu et peuvent ensuite être intégrées pour sectionner et de l'analyse par immunohistochimie ou enzymatiquement digéré pour l'analyse avancée par cytométrie de flux. En utilisant le tissu pulmonaire sous forme de biopsies bronchiques obtenues à partir de bronchoscopies confère l'avantage de rendre possible la réalisation de la study sur des volontaires sains, contrairement à la chirurgie ouverte des poumons qui, pour des raisons évidentes, est limitée aux patients qui nécessitent une chirurgie thoracique. En outre, le tissu qui est échantillonné au cours d'une bronchoscopie chez des volontaires sains est physiologiquement normal, contrairement à une zone non affectée du tissu pulmonaire chez les patients présentant une maladie pulmonaire. D'autre part, les biopsies sont faibles et le nombre de cellules récupérées, même lorsque la mise en commun de plusieurs biopsies, limite le type d'analyses qui peuvent être effectuées.

Bien que le présent travail se concentre sur les pays en développement, les méthodes décrites peuvent être directement élargi pour inclure d'autres cellules (immunitaires) d'intérêt qui résident dans le tissu muqueux de poumon humain. En outre, les protocoles sont également directement applicable à des échantillons prélevés sur des patients souffrant de maladies pulmonaires où la bronchoscopie fait partie de l'établissement du diagnostic, telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), la sarcoïdose, ou d'un cancer du poumon.

Protocol

NOTE: Cette recherche a été approuvé par le Conseil d'examen éthique régionale à Umeå, en Suède. 1. bronchoscopie pour échantillonnage endobronchique biopsies de sujets humains Obtenir le consentement éclairé de tous les participants. Traiter les sujets avec le midazolam par voie orale (4-8 mg) et glycopyrronium par voie intraveineuse (0,2 à 04 mg) 30 min avant la bronchoscopie. Appliquer une anesthésie topique avec de la lidocaïne dans le larynx et les…

Representative Results

Les études caractérisant les cellules immunitaires humaines respiratoires tissus-résident, y compris les pays en développement, sont limitées, en grande partie en raison du fait que chirurgicalement enlevé ou tissu entier de poumon humain est rare. Ici, une méthode moins invasive d'obtenir le tissu pulmonaire à partir de biopsies bronchiques (EBB) des volontaires sains et des protocoles mis au point pour étudier les cellules immunitaires dans le tissu par immunohistochimie o…

Discussion

Cet article décrit comment générer une caractérisation spatiale et phénotypique détaillée du poumon PED tissus résidents chez l'homme sain par immunohistochimie et cytométrie en flux sur des biopsies muqueuses bronchiques recueillies au cours de la bronchoscopie. Dans les paragraphes qui suivent les étapes critiques dans le protocole sont discutés en détail.

Étapes critiques avec le Protocole

Sectionner et immunohistochimie: Il est essentiel de gard…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier les bénévoles qui ont contribué matériel clinique à cette étude. Nous sommes également reconnaissants envers le personnel du ministère de la Santé publique et de la médecine clinique, Division de la médecine / médecine respiratoire, Hôpital universitaire, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) pour la collecte de tout le matériel clinique.

Ce travail a été soutenu par des subventions à l'AS-S du Conseil suédois de la recherche, la Fondation suédoise Heart-Lung, la Fondation suédoise pour la recherche stratégique et le Karolinska Institutet.

Materials

Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160 Olympus BF1T160
Light source  Olympus Exera CV-160
Fenestrated forceps Olympus FB21C Used to take biopsies
Bite Block Conmed 1429 20x27mm
Glucose 25%  500mL intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40mg/mL Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100mg/ml spray Administered to back of throat
Lidocaine 20mg/ml spray Administered via bronchoscope to airways
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA processing and embedding
Glass vials 5mL
Acetone Sigma-Aldrich 32201-1L
Molecular sieves, 4A Alfa Aesar 88120 3-4mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P-7626 0.035g/100ml acetone
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I-6125 0.37g/100ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules TAAB laboratories C094 x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder TAAB laboratories C054 Holds 25 8mm capsules
JB-4 GMA embedding kit Polysciences 00226 Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate Sigma-Aldrich 27614-1L
Silica gel with humidity indicator Scharlau GE0043 2.5-6mm 
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA sectioning
Glass microscope slides ThermoFisher Scientific 10143562CEF Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution Sigma-Aldrich P8920-500mL 1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy Alkar
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287 Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker LKB
Capsule splitter TAAB laboratories C065
Carbon steel single edge blades TAAB laboratories B054
Vice
Ammonia, 25% VWR 1133.1000 2mL in 1L, 1:500 (0.05%)
Microtome Leica Leica RM 2165
Light source Leica Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand Leica Leica MZ6
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen Histolab 5218
Hydrogen peroxide 30% solution AnalaR Normapur 23619.264
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032
Tris Roche 10708976001
Sodium chloride VWR chemicals 27810.295
Bovine serum albumin Millipore 82-045-2 Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5546
Anti-human CD45 antibody BioLegend 304002 Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody AbD Serotech MCA80GA Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control Abcam ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control Dako X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit Vector Labs PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite Vector Labs SK-4200
Mayers haematoxylin HistoLab 01820
Permanent Aqueous Mounting Medium AbD Serotech BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution  VWR 360292F
Light microscope Leica Leica DMLB
Microscope camera Leica Leica DFC 320
Analysis software Leica Leica Qwin V3
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich 55021C
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
Collagenase II Sigma-Aldrich C6885
DNase Sigma-Aldrich 10104159001 ROCHE
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Forceps
Platform rocker Grant instruments PMR-30
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22
40 µm cell strainer Falcon 352340
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit Life Technologies L34957
CD45 BD 555485
CD3 BD 557757
CD20 BD 335829
CD56 Biolegend 318332
CD66abce Miltenyi 130-101-132
HLA-DR BD 555813
CD14 BD 557831
CD16 Biolegend 302026
CD11c BD 560369
CD1c Miltenyi 130-098-009
CD141 Miltenyi 130-090-514
CD103 Biolegend 350212
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775
LSR II Flow cytometer BD Flow cytometer
FlowJo FlowJo Software for analysis

References

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Baharom, F., Rankin, G., Scholz, S., Pourazar, J., Ahlm, C., Blomberg, A., Smed-Sörensen, A. Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (119), e55222, doi:10.3791/55222 (2017).

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