Summary

면역 및 유동 세포 계측법을 사용하여 기관지 생검의 공간 분포 및 표현형 확인 : 인간의 폐 수지상 세포

Published: January 20, 2017
doi:

Summary

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Abstract

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Introduction

폐는 외부 환경과 연속적인 접촉이 높은 질환을 유발하는 능력 모두에 무해 입자와 미생물에 노출된다. 따라서, 침입 병원균에 대한 강력한 면역 반응을 탑재 면역계에 중요하지만, 질병의 원인이없는 흡입 항원에 대한 내성을 유지하는 것도 중요하다. 강력한 면역 감시를 제공하기 위해 호흡기는 수지상 세포를 포함하여 면역 세포의 네트워크 늘어서있다. 수지상 나이브 T 세포를 활성화 할 수있는 독특한 능력을 가진 전문적인 항원 제시 세포이다. 인간 폐, 상주 수지상 항원 다음 프로세스가 발생하여 T 세포를 1, 2, 3으로 표시 및 활성화에 대한 폐 림프절로 전송.

인간 면역계 DCS는 디스탱으로 여러 서브 세트들로 분할 될 수있다CT하지만 중복 기능 : CD1c +와 CD141 + 골수성 수지상 세포 (MDC에) 및 CD123 + 형질 DC가 (올라가고) 4, 5. 인간 수지상 가장 상세한 기술은 혈액 유래 연구 동안, 인간의 폐는 T 세포 자극 용량 6, 7, 8, 9 DC 서브 세트 드문 인구 항구 것이 이제 명백하다. 그러나, 누적 데이터는 수지상 세포를 포함하는 면역 세포가 자신의 해부학 적 위치 (10)에 따라 빈도, 표현형 및 기능에 차이가 있음을 보여준다. 따라서, 로컬 면역 관용에 대한 그들의 기여를 이해하기 위해 관련 조직에서 면역 세포를 연구하는 것이 중요하다. 함께 찍은,이 혈액 DC가 더 쉽게 사용 가능하고 접근에도 불구하고, 폐 질환을 해결하면 폐 상주 수지상 세포를 연구 할 필요성을 강조 인간한다.

인간 폐 상주 수지상 조사 제의 연구는 주로 면역 11, 12, 13을 이용하여 조직 절편에서 형태 및 HLA-DR의 CD11c와 같은 하나의 마커의 발현에 의존했다. 대조적으로, 통상적으로 유세포에 의존 더 최근의 연구는 다양한 면역 세포 서브 세트를 연구 분석한다. 그 고유 특정 DC 서브 세트를 식별하는 하나의 세포 표면 마커를 찾는 것은 어렵다 때문에, 연구의 전위 한계는 단지 4 색은 유세포인가하는 수지상 세포와 유사한 표현형 마커와 세포 집단 등의 위험이있다. 예를 들어, 중 CD11c 모든 골수성 수지상 세포와 단핵 세포의 대부분에 표현된다. 한편, 연구 고급 유동 세포 계측법 패널을 적용하여 환자의 수술 적 절제로부터 비 암성 폐 조직은 통상적으로 사용 된외부 참조 "> 10, 14, 15, 16은, 이들 희소 인구 건강한 피험자의 DCS 본 진정 대표 불분명 않는다. 전체적으로 연구 인해 수술 제거 또는 전부를 인간 폐 조직이 부족하다는 사실에 크게 제한된다.

이러한 한계들을 극복하기 위해,이 작품은 공간 분포와 기관지 내시경을 받아야 건강한 지원자에서 얻은 점막 기관지 생검에서 수지상 세포의 표현형 식별에 대한 자세한 분석을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 작은 생검 각에서 수집 될 수 있고,이어서 절편 분석 고급 유세포 분석을위한 분해 효소를 사용하여 면역 조직 화학 또는 임베디드 될 수있다. bronchoscopies 얻은 기관지 생검 형태의 폐 조직을 사용하는 것은 가능 명세서를 수행 할 수있게하는 장점을 부여udy는 건강한 지원자에서, 폐의 개복 수술과는 달리 분명한 이유, 흉부 수술이 필요한 환자에게 제한되어있다. 또한, 건강한 지원자에서 기관지 중 샘플링되는 조직은 폐 질환을 가진 환자의 폐 조직의 영향을받지 않는 영역에 대조적으로, 생리 학적으로 정상인. 한편, 생검 작은 여러 생검 풀링에도 검색된 셀의 수는 수행 될 수있는 분석의 유형을 제한한다.

본 연구는 수지상 세포에 초점을 맞추고 있지만, 직접 확장 할 수 있습니다 설명하는 방법은 인간의 점막 폐 조직에있는 관심의 다른 (면역) 세포를 포함합니다. 또한, 프로토콜은 기관지 같은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 유육종증, 폐 암으로 진단을 확립의 일부 폐 질환을 앓고있는 환자로부터 얻은 샘플에 직접 적용 할 수있다.

Protocol

참고 :이 연구는 우메 아, 스웨덴의 지역 윤리 심의위원회에 의해 승인되었다. 인간의 주제에서 샘플링 기관지 생검 1. 기관 지경 모든 참가자의 동의를 얻습니다. 경구 용 미다 졸람 (4-8 mg) 및 정맥 glycopyrronium (0.2-04 mg을)를 기관지 전에 30 분으로 주제를 취급합니다. 후두와 기관지에 리도카인으로 국소 마취를 적용합니다. 리도카인 4 % ~ 3 ㎖와 제목 양치질을?…

Representative Results

DC를 비롯한 인간 호흡기 조직 상주 면역 세포를 특성화 연구는 주로 수술로 인해 제거되거나 전체 인간 폐 조직이 부족하다는 사실을 한정한다. 여기서, 면역 세포 계측법을 사용하여 조직의 면역 세포를 분석하거나, 유동 건강한 지원자 및 개발 프로토콜 기관지 생검 (EBB)로부터 폐 조직을 얻는 덜 침습적 방법이 설명된다. ?…

Discussion

이 논문은 면역 조직 화학 염색을 이용하여 건강한 인간의 폐 조직 상주 수지상의 상세한 공간 및 표현형 특성을 생성하고 기관지 동안 수집 된 기관지 점막 생검에 유동 세포 계측법하는 방법에 대해 설명합니다. 다음 단락에서 프로토콜의 중요한 단계를 자세히 설명합니다.

프로토콜과 중요한 단계

단면 및 면역 : 그것은 그들이 (단계 2.5)를 사용하지 않…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는이 연구에 임상 자료를 공헌 한 자원 봉사자에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 모든 임상 자료의 수집을위한 보건 임상 의학, 의학 / 호흡기 의학 전공, 대학 병원, 우메 (Norrlands의 universitetssjukhus)의 부서의 직원들에게 감사하다.

이 작품은 스웨덴 연구 협의회, 스웨덴 심장 – 폐 재단, 전략적 연구를위한 스웨덴 재단과 카롤린스카 연구소에서 AS-S에 보조금에 의해 지원되었다.

Materials

Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160 Olympus BF1T160
Light source  Olympus Exera CV-160
Fenestrated forceps Olympus FB21C Used to take biopsies
Bite Block Conmed 1429 20x27mm
Glucose 25%  500mL intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40mg/mL Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100mg/ml spray Administered to back of throat
Lidocaine 20mg/ml spray Administered via bronchoscope to airways
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA processing and embedding
Glass vials 5mL
Acetone Sigma-Aldrich 32201-1L
Molecular sieves, 4A Alfa Aesar 88120 3-4mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P-7626 0.035g/100ml acetone
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I-6125 0.37g/100ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules TAAB laboratories C094 x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder TAAB laboratories C054 Holds 25 8mm capsules
JB-4 GMA embedding kit Polysciences 00226 Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate Sigma-Aldrich 27614-1L
Silica gel with humidity indicator Scharlau GE0043 2.5-6mm 
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA sectioning
Glass microscope slides ThermoFisher Scientific 10143562CEF Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution Sigma-Aldrich P8920-500mL 1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy Alkar
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287 Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker LKB
Capsule splitter TAAB laboratories C065
Carbon steel single edge blades TAAB laboratories B054
Vice
Ammonia, 25% VWR 1133.1000 2mL in 1L, 1:500 (0.05%)
Microtome Leica Leica RM 2165
Light source Leica Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand Leica Leica MZ6
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen Histolab 5218
Hydrogen peroxide 30% solution AnalaR Normapur 23619.264
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032
Tris Roche 10708976001
Sodium chloride VWR chemicals 27810.295
Bovine serum albumin Millipore 82-045-2 Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5546
Anti-human CD45 antibody BioLegend 304002 Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody AbD Serotech MCA80GA Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control Abcam ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control Dako X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit Vector Labs PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite Vector Labs SK-4200
Mayers haematoxylin HistoLab 01820
Permanent Aqueous Mounting Medium AbD Serotech BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution  VWR 360292F
Light microscope Leica Leica DMLB
Microscope camera Leica Leica DFC 320
Analysis software Leica Leica Qwin V3
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich 55021C
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
Collagenase II Sigma-Aldrich C6885
DNase Sigma-Aldrich 10104159001 ROCHE
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Forceps
Platform rocker Grant instruments PMR-30
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22
40 µm cell strainer Falcon 352340
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit Life Technologies L34957
CD45 BD 555485
CD3 BD 557757
CD20 BD 335829
CD56 Biolegend 318332
CD66abce Miltenyi 130-101-132
HLA-DR BD 555813
CD14 BD 557831
CD16 Biolegend 302026
CD11c BD 560369
CD1c Miltenyi 130-098-009
CD141 Miltenyi 130-090-514
CD103 Biolegend 350212
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775
LSR II Flow cytometer BD Flow cytometer
FlowJo FlowJo Software for analysis

References

  1. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  2. Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
  3. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
  4. Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
  5. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
  6. Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
  7. Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
  8. Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
  9. Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
  10. Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
  11. Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
  12. Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
  13. van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
  14. Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
  15. Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
  16. Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
  17. Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
  18. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  19. Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
  20. Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
  21. Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
  22. Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).

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Baharom, F., Rankin, G., Scholz, S., Pourazar, J., Ahlm, C., Blomberg, A., Smed-Sörensen, A. Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (119), e55222, doi:10.3791/55222 (2017).

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