Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.
The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.
In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine1. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies2, as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals3 and systemic pharmacological manipulations in humans4. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems5,6 and can lead to changes in neural activity3.
Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug7. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules8, correlating with the tip diameter9 of the micropipette as well as with the concentration8 of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used10, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.
Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley11 for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain12) to a defined brain area13 while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette13. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly14 and intracellularly15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see17 for a comparison of recent pressure injection systems).
An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.
The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.
Aqui temos ilustrado em detalhes como realizar injeções fiáveis e precisos e gravações de uma única célula de alta qualidade com um sistema de injeção de pressão "off-the-shelf". Embora este método de administração de fármaco tenha sido previamente usado em comportando macacos (revisto em 17), o sistema aqui apresentado tem vantagens, analisados a seguir.
Como ilustrado na Figura 4A, o sistema aqui descrito pode fornecer uma medição única estável de actividade neuronal com e sem injecções farmacológicos na vizinhança directa do local da gravação. Como mostrado na Figura 4B, a injecção de uma substância de controlo, soro fisiológico, não conduzir a uma mudança na taxa de disparo. Este controlo demonstra que o próprio processo de injecção não tem nenhuma influência mensurável sobre as propriedades de disparo dos neurónios gravados.
A configuração espacial do neurónio, eléctrodo de registo, e micropipeta é de fundamental importância nestas experiências. Embora uma medida precisa de suas posições relativas no tecido durante a gravação não for possível, pode-se considerar e controle para possíveis fontes de variação. Em primeiro lugar, durante a injecção do volume existe um risco de que o neurónio de interesse pode ser deslocada para fora do eléctrodo de registo, que afectam a estabilidade de sinais gravados. Por essa razão, é prudente para comparar a taxa de disparo antes e depois do bloco de injecção para verificar a estabilidade de sinal. Em segundo lugar, a configuração do tubo de guia do sistema de registo define a distância entre os eléctrodos e micropipeta (por exemplo., 305 uM no sistema de três-canal concêntrico utilizado nesta experiência). À medida que o sistema proporciona um controlo preciso para a posição de profundidade de eléctrodos e micropipeta no tecido, a distância entre eles pode ser minimizado através da calibração cuidadosamente profundidade relativa antes de gravar (passo 3.5), e mantendo-os a uma profundidade comum durante gravações.
ent "> limitações potenciaisInserindo a micropipeta para o sistema é mais exigente do que a inserção do eléctrodo, como o diâmetro da micropipeta é ligeiramente maior e o material é mais frágil. Além,juntar o tubo para o pino da micropipeta é um desafio uma vez que implica um elevado risco de quebrar a parte superior da micropipeta. No entanto, o tempo de vida de uma micropipeta carregado com êxito é de vários meses, mesmo com o uso diário.
Na prática, significa que ainda não encontrou um bloqueio no sistema de injecção durante a limpeza pós-gravação do sistema. No entanto, nenhuma verificação de "on-line" é possível, e há um risco de que um bloqueio físico (tal como o tecido na ponta da micropipeta) pode evitar a injecção de substâncias. Portanto, pode ser aconselhável para analisar os dados de forma conservadora, como incluindo apenas as células em uma análise mais aprofundada que apresentam alterações significativas em disparar as taxas entre controle e injeção de blocos do experimento.
Apesar de seu pequeno diâmetro, microeletrodos e pipetas irá deslocar o tecido cerebral e pode causar algum dano tecidual local. Isto pode ser minimizado por posicionamento manualmente a ponta do thtubos e guia logo acima da dura-máter. Os eletrodos em seguida, penetrar na dura-máter e sua intactness é inferida medindo suas impedâncias online. Em seguida, a micropipeta é inserido. Ao usar esta abordagem, a remoção regular do tecido da dura-máter acima é recomendada para reduzir ainda mais o risco de eléctrodo ou pipeta ruptura.
Comparação dos métodos alternativos
O sistema utilizado aqui mostra vantagens claras em comparação com outros sistemas de injeção de pressão. Uma grande vantagem é o diâmetro da micropipeta (aproximadamente 100 uM), que é metade do tamanho de outras sondas disponíveis 17 e, portanto, minimiza os danos de tecido neural. Em contraste com modelos anteriores, o atual sistema emprega espacialmente separados eletrodo de registro e micropipeta. Embora outros sistemas fornecem uma distância menor entre o eletrodo e pipeta, o sistema descrito aqui permite mudanças de profundidade independentes de eletrodos e pipeta, portanto, permitting distâncias relativas variável dentro de uma sessão de gravação. Mais importante, nenhum compromisso quanto à qualidade de gravação tem de ser feita, como o sistema de injecção é uma extensão de um dispositivo de gravação estabelecida. Embora apenas uma micropipeta e, portanto, uma substância é utilizada neste protocolo, é possível injetar várias substâncias no prazo de um procedimento experimental. Para alcançar este objectivo, vários micropipetas pode ser enfiado para dentro de tubos de guia separados e ligados a seringas montados em bombas de injecção individuais. Finalmente, o sistema de controlo é fácil, uma vez que apenas um programa de computador é necessária para fazer avançar os eléctrodos e micropipeta, e para executar a injecção de pressão durante a experiência.
Comparando injecção pressão para iontoforese, há vantagens e desvantagens relativas. Por exemplo, a injecção de pressão requer um maior volume a ser introduzidas no tecido do que a iontoforese, aumentando assim o risco de deslocamento neuronal. O proto atualcol usado volumes na faixa NL, e raramente experimentaram mudanças perceptíveis na qualidade do sinal de uma célula gravado. O sistema também permite que um maior volume a ser injectado, a qual é potencialmente útil para manipulações comportamentais mas poderia ter impacto estabilidade de gravação neuronal. A clara vantagem de injeção de pressão sobre iontoforese é a maior variedade de substâncias utilizáveis como não há exigência de utilização de substâncias carregadas. No entanto, os valores de pH devem ser verificados e comparados entre substâncias experimentais e de controle (por exemplo., Solução salina).
A pergunta pode surgir por que usar o método de longa data de injeção de pressão em vez de técnicas mais recentes, como optogenética para manipular a atividade neural. Embora bem estabelecido em roedores, Optogenetics ainda não está estabelecida de forma fiável em macacos rhesus. Em particular, ele ainda não permite a manipulação local de células selectivos para um tipo de neurotransmissor particular. A mais longo prazo, vemosgrande potencial para a combinação das vantagens de manipulações farmacológicas com as vantagens de manipulações optogentic na elucidação da base neural das funções cognitivas.
Aqui mostramos como injecção de pressão pode ser usada para manipular farmacologicamente uma área restrita localmente no cérebro de acordado, comportando-se macacos rhesus. Esperamos que este método inspira outros cientistas para investigar as contribuições neuromoduladores para a dinâmica da atividade neuronal.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Deutsche Forschungsgemeinschaft através do Collaborative Research Center 889 "celulares mecanismos de processamento sensorial" para ST (Projecto C04). Agradecemos Sina Plümer, Leonore Burchardt, Dirk Prusse, Klaus Heisig e Ralf Brockhausen para apoio técnico e animal-relacionados e os nossos colaboradores na Unidade de Células-Tronco do Centro Alemão de Primatas, Dr. Katharina Debowski e Anna Magerhans, para a assistência técnica na processo de filtração.
(-)-Scopolamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 55-16-3 | Mr 339.81 g/mol |
NaCl 0.9% | B. Braun Melsungen AG | 3079870 | 5ml |
Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | enzyme detergen |
Hydrogen peroxide | Roth | Used in 3% solution with deionized water | |
Ethanol | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
Deionized water | |||
Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | Syringe and needle |
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
Quarzglass micropipette | Thomas Recording | ||
Recording electrode | Thomas Recording | quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ and 0.3-0.5 MΩ | |
PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain Performance Plastics | 3702003 | Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm) |
Loctite 401 | Henkel | 233641 | Superglue |
Silicon oil | Thomas Recording | M-1000 | |
Minisart RC15 | Sartorius | 17761———-R | Syringe filter |
Multichannel Micro Injection System | Thomas Recording | multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump | |
McLab | custom | internal lab software to control stimulus presentation |