Ein Druckinjektionssystem zur Untersuchung der Neuropharmakologie der Informationsverarbeitung in Awake Behaving Makaken Cortex

Tierpflege und alle experimentellen Verfahren wurden nach den deutschen Gesetzen der Tierpflege und genehmigt von der Bezirksregierung Braunschweig, Niedersachsen, Deutschland durchgeführt. Hinweis: Da das Experiment in vivo durchgeführt wird, ist es entscheidend , eine möglichst hohe Hygienestandards aufrechtzuerhalten. Wann immer möglich, arbeiten unter sterilen Bedingungen. 1. Stellen Sie die Injektion / Recording System vorbereiten Sterilisieren das Rohr, das die Mikropipette mit der Spritze verbindet. Verwenden Sie die kürzeste Länge des Rohres möglich, in der Versuchsaufbau zwischen Einspritzpumpe und elektroAufzeichnungsSystem. Reinigen Sie die Führungsrohre des Aufzeichnungssystems mit Reinigungsdrähte. Tauchen sie in sterilen Silikonöl und füttern sie durch die einzelnen Führungsrohre mehrmals. Legen Sie die Quarzglas-Mikropipette in ein Führungsrohr des Aufzeichnungssystems. Siehe Abbildung 1A. Nach dem Fixieren der Mikropipette indas Aufzeichnungssystem, heften sich an den Metallstift des Mikro die sterilen Röhrchen. Pass auf; obwohl die Mikropipette im System festgelegt ist, kann sie leicht brechen, wenn das Rohr anbringen. Verwenden Sie zwei sterile Pinzette gleichen Druck auf den Stift und das Rohr aufzubringen. Verwenden Flüssigkeit Superkleber die Verbindung zwischen Rohr und Mikro abzudichten. Warten Sie mindestens 3 Stunden für den Kleber vor dem Befüllen der Mikropipette mit Flüssigkeit zu härten. Einfügen Mikroelektroden (beispielsweise Quarzglas isolierten Platin Wolfram) in den anderen Positionen des Aufzeichnungssystems vor oder nach dem Einsetzen Mikropipette. 2. Vorbereitung des Stoffes Sterilisieren 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die spätere Lagerung von Injektionslösungen einen Autoklaven oder andere zuverlässige Verfahren. Wiegen Sie die entsprechenden Substanz Scopolamin-hydrochlorid 5 ml einer 0,1 molaren Lösung herzustellen. Man löst in steriler Kochsalzlösung (0,9% NaCl). Unter sterilen Bedingungen ina Dunstabzug, filtern Sie die Lösung mit einem Spritzenfilter mit ausreichend großen Porendurchmesser unter Verwendung von zB 0,2 & mgr; m. Unter der Dunstabzug, Aliquotierung der Lösung in Mengen ausreichend für ein einzelnes Experiment, zum Beispiel für Scopolamin, 500 & mgr; l in sterile 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie dunkle Röhren, die Substanz vor Licht zu schützen; alternativ wickeln Rohre in Aluminiumfolie. Für Scopolamin, speichern Sie die Lösung für bis zu 14 Tage bei 4 ° C. 3. Tägliche Vorbereitung der Injektion / Recording System Hinweis: Wenn in dem Aufzeichnungssystem montiert ist, werden die Elektroden und Mikro gespeichert in einer Enzymlösung (Tergazyme, 1% ige Lösung mit deionisiertem Wasser) zwischen den Aufnahmen. Die folgenden Schritte müssen vor jeder Aufnahme durchgeführt werden. Sammeln eines Rohrs der Substanz eingespritzt werden. Lassen Sie es auf RT kommen, wenn gekühlt. Entfernen Sie die Injektion / Aufzeichnungssystem aus der Enzymlösung und spülen Elektrodenund Mikropipette mit VE-Wasser zu reinigen vollständig Enzymlösung. Entfernen Sie die vordere Abdeckung des Aufzeichnungssystems überprüfen, um visuell die Dichtung zwischen Mikro und Rohr. Bewerben sterilen Silikonöl auf das Führungsrohr Lücke (siehe Abbildung 1A) und Spitzen der Elektroden und Mikro, um das System für die reibungslose Bewegung zu schmieren. Prüfen Sie Tipps von Elektroden und Mikropipette mit einem Mikroskop auf Unversehrtheit zu gewährleisten. Ausrichten der Elektroden und der Mikropipette unter dem Mikroskop, so dass sie aus der Führungsrohre mit der gleichen Länge erstrecken. Fahren sie in die Führungsrohre, Stoppen, sobald sie nicht mehr sichtbar sind. Dies wird als Elektrodenposition Null definiert. Eingestellt, die Tiefe der Elektroden und Mikropipette auf 0 in der Software. Füllen Sie eine sterile Spritze mit steriler Kochsalzlösung und führen Sie die Nadel in die Röhre, kümmert sich nicht um die Wand des Rohres zu durchbohren. Treiben die Mikropipette aus dem Führungsrohr für visual Kontrolle der Stoffstrom. Flush mindestens 2 ml steriler Kochsalzlösung durch das Röhrchen und Mikropipette keine Luft sicherzustellen bleibt in der Spritze oder in die Röhre. Nicht zu viel Druck auf den Kolben der Spritze anzuwenden. Sicherstellen, dass die Verbindung zwischen Rohr und Mikro abgedichtet wird. Wenn Leckage sichtbar ist, wieder kleben Sie die Kreuzung (siehe Schritt 1.5) und die Aufnahme zu verschieben. Füllen Sie eine neue sterile Spritze mit der Lösung injiziert werden und es mit dem Lauf der Salz Spritze auszutauschen, das heißt, halten Sie die Nadel der Kochsalzlösung gefüllte Spritze in die Röhre. Stellen Sie sicher, dass keine Luft in das System übertragen wird. Dies wird am besten erreicht, indem die Nadelnabe mit Kochsalzlösung füllen, nachdem die Kochsalzlösung gefüllte Trommel zu entfernen. Spülen Sie das System mit 250 ul der Lösung injiziert werden, um vollständig die Kochsalzlösung aus dem Rohr zu entfernen. Verwendung der Motorsteuerungssoftware einfahren Elektroden und Mikropipette in die guidetubesto eine Tiefe von mindestens -500 um. <li> Senken Sie das Führungsrohr Ring (1A) an der Unterseite der Führungsrohre ihre festen relativen Position zu halten. Reinigen Sie die Basis des Systems mit Ethanol, insbesondere dann, wenn es die Affen Aufnahmekammer berührt. Schließen Sie das Aufzeichnungssystem durch die vordere Abdeckung zu ersetzen und die Schrauben festziehen. 4. Validierung des Einspritzsystems Hinweis: Obwohl das Unternehmen das System kalibriert, ist es empfehlenswert, die ausgeworfenen Bände mit den Materialien in den Versuchsaufbau (Schläuche, Spritzen etc.) zu validieren. Bereiten, das System als in Schritt 3 beschrieben, halten Elektroden und Mikropipette aus den Führungsrohren verlängert. Eine Tiefe von mindestens 7,000 & mgr; m wird empfohlen, entlang der äußeren Oberfläche der Mikropipette und der Elektroden aufgrund von Haftungsverlust des Messvolumens zu vermeiden. Legen Sie das Aufzeichnungssystem in der Lage, es verwendet wird, während des Experiments in und setzen Sie den syringe in die Mikroinjektionspumpe. Befestigen Sie die Spritze an Ort und Stelle mit dem Gummiband und verstellbaren Griff (siehe Abbildung 1A). Schieben Sie den beweglichen Teil der Pumpe, bis sie fest an ihrem Platz hinter dem Kolben der Spritze ist. Verwendung der softwaregesteuerten Motoreinheit auszuwerfen ein Volumen groß genug , um genau gemessen zu werden, z. B. 1.000 nl. Es ist bevorzugt, einen einzigen Schritt zu verwenden, um das Gesamtvolumen um auszuwerfen Wirkungen Kapillarwirkung entlang der Mikropipette Oberfläche zu vermeiden. Sehr niedrige Geschwindigkeiten (1 nl / s) kann auch während der Validierungsverfahren zu diesem Effekt führen. Sammeln Sie das Gesamtvolumen in einem Behälter unter der Mikropipette platziert, oder vorsichtig den ausgestoßenen Tropfen direkt von der Spitze der Mikropipette zu sammeln. Schätzen Sie das ausgeworfene Volumen mit einer Pipette oder durch mit einer Präzisionswaage. Wiederholen Sie den Vorgang mehrmals Messungen bestätigen. 5. Akute Recordings Stellen Sie die xy-Positiondes Aufzeichnungssystems. Dies definiert den Punkt, an dem die Führungsrohre der Dura mater in der chronisch implantierten Aufnahmeraum gelangen. Achten Sie darauf, die Führungsrohre vollständig zurückgezogen sind (Führungsrohr z-Position 0). Bringen Sie das Aufnahmesystem in die richtige Position und legen Sie die Spritze in der Mikroinjektionspumpe. Befestigen Sie die Spritze an Ort und Stelle mit dem Gummiband und verstellbaren Griff (siehe Abbildung 1A). Schieben Sie den beweglichen Teil der Pumpe, bis sie fest an ihrem Platz hinter dem Kolben der Spritze ist. Wenn ein Tropfen der Substanz an der Spitze der Führungsrohre sichtbar ist, entfernen Sie vorsichtig eine sterile Wattestäbchen verwenden. Bereiten Sie das Tier zur Aufzeichnung nach dem Verfahren des Labors (siehe 18 zB Richtlinien). Sichere Montage des Aufzeichnungssystem auf der Aufzeichnungskammer des Affen. Langsam manuell die Führungsrohre in die Aufnahmekammer abzusenken, bis die dura erreicht ist, fahren dann die Elektroden den Motor Co mitntrol Software. Da es nicht möglich ist, Impedanz der Mikropipette zu messen, zuerst mit Elektroden treiben und ihre Impedanzen regelmäßig in verschiedenen Tiefen überprüfen. Nach einer Penetration der Dura erfolgreich ohne Beschädigung der Elektroden durchgeführt wird, vorab die Mikropipette. Treiben die Elektroden und der Mikropipette an die Zielelektrode Tiefe, bei der das Gehirn Bereich von Interesse erwartet wird, gefunden werden. vorzurücken langsam die Elektrode bis es nahe genug ist, um die Aktivität einer einzelnen Einheit zu erfassen, wie es durch ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis in dem aufgezeichneten Signal belegt. Wichtig ist, positionieren die Aufzeichnungselektrode und der Mikropipette in derselben Tiefe der Mindestabstand zwischen der Elektrode und Mikropipette zu gewährleisten. Wenn möglich, die Elektroden und Mikro in dieser Tiefe für die gesamte Aufzeichnung. Wenn jedoch der einzige Weg, die Signalqualität des aufgezeichneten Zelle zu halten ist, um die Elektroden zu bewegen, fahren dann die Elektroden und der Mikropipettegleichzeitig den Abstand zwischen ihnen zu halten. 6. Räumliche Achtung Aufgabe In einer Reihe von Studien, präsentieren zwei bewegliche Punktmuster auf dem Bildschirm, in dem rezeptiven Feld des aufgenommenen Neuron positioniert einen und dem anderen außerhalb davon, zusammen mit einem zentral präsentierten Fixationspunkt , dass das Tier während jeder Versuch zu foveate hat 19, 20. Hinweis: Der Affe trainiert wird , auf eine Richtungsänderung in der cued Punktmuster (das Zielereignis) zu ignorieren , jede Richtungsänderung in der anderen Punktmuster zu reagieren, und wird mit einem Tropfen Flüssigkeit für jeden erfolgreichen Abschluss einer Studie 19 belohnt, 20. Als sensorische Kontrollbedingung, hat der Affe eine Helligkeitsänderung des Fixationspunkt zu berichten , während beide bewegende Punktmuster zu ignorieren (Abbildung 2 für eine detailliertere Beschreibung der Aufgabe sehen). 7. Pharmakologische Manipulation während der Aufnahme <p> Hinweis: Während der Affe die Aufgabe ausführt, die Substanz in einem blockweise injizieren. Drei aufeinanderfolgende Blöcke definiert: Steuerung, die als Grundlage dient; während dessen Injektion, ein Stoff ausgestoßen; und Erholung, in denen gezielt die Zellen durch die Injektion Rückkehr zum Ausgangswert. Während eines Einspritzblock injizieren eine vordefinierte Menge der Substanz in regelmäßigen Abständen z. B. 2 nl pro Minute mit einer Rate von 2 nl / s. Für dieses Beispiel verwenden Scopolamin-Hydrochlorid. Der Einspritzvorgang wird mit einer Software gesteuert, die verschiedene Optionen zur Verfügung stellt. Verwenden Sie zum Beispiel die Sprungfunktion Injektionsvolumen zu definieren, und drücken Sie den Injektionsknopf jede Minute nach dem Takt der Aufnahmesoftware. Hinweis: Die genaue Dauer der Injektion Block Substanz ist und experimentieren abhängig, zum Beispiel für Scopolamin Gebrauch 2 nl Injektionen pro Minute für 10 Minuten (20 nl insgesamt).. Es wird bevorzugt, nicht die Elektroden und Mikro duri voranng der Injektionsblock. Beachten Sie die Zeit und den Versuch, in dem die Substanz injiziert wird, um die Tiefe der Elektroden und Mikropipette, sowie die Menge der ausgestoßenen Substanz. Folgen Sie der Injektionsblock mit einem Wiederherstellungsblock, in dem keine Substanz injiziert wird. Die Dauer des Wiederherstellungsblock ist stoffspezifisch und muss in Vorversuchen festgelegt werden. Überwachen und halten Sie die Aufnahmequalität der ausgewählten einzelnen Einheiten bis zum Ende des Wiederherstellungsblock. Wiederholen Sie die drei Blöcke für so lange, wie die Aufnahmequalität und Motivation des Affen ermöglichen. 8. Beitrag Aufnahmeverfahren Nach der Datenaufzeichnung, einfahren Elektroden und Mikro in die Führungsrohre und dann die Führungsrohre manuell zurückzuziehen. Entfernen Sie das Aufzeichnungssystem von der Aufzeichnungskammer des Affen. Lassen Sie die Spritze aus der Einspritzpumpe und übertragen das System in den Vorbereitungsbereich für die Reinigung. Behandeln Sie das Tier(einschließlich Reinigung des Aufnahmeraums 18) nach den Standardverfahren des Labors und die Rückgabe an das Gehäuse Möglichkeiten. Spülen der Außenseite der Führungsrohre mit Wasserstoffperoxid (3%) und dann mit deionisiertem Wasser. Antriebselektroden und Mikropipette aus den Führungsrohren, Spülen mit Wasserstoffperoxid und anschließend entionisiertes Wasser. Austausch der Zylinder der Spritze mit einem Zylinder einer Spritze mit steriler Kochsalzlösung gefüllt ist, hält die Nadel in der Röhre. Spülen Sie die Schläuche und die Mikropipette mit 1-2 ml Salzlösung. Nach dem Spülen entfernen Sie den Lauf und füllen Sie es mit Luft. Setzen Sie den Lauf in die Nadel und trocknen Sie die Röhre und die Mikropipette von innen, indem Luft durch vorsichtig hineinschieben. Lagern Sie die Führungsrohre, verlängerte Elektroden und Mikro in der Enzymlösung eingetaucht ein Austrocknen zu verhindern sowie den Abbau von organischem Material zu gewährleisten.