Een Pressure Injection systeem voor het onderzoeken van de Neurofarmacologie van Information Processing in Awake Behaving makaak Monkey Cortex

Dierenverzorging en alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wetgeving met betrekking tot de verzorging van dieren en door het district regering van Braunschweig, Nedersaksen, Duitsland goedgekeurd. Opmerking: Als het experiment wordt uitgevoerd in vivo, is het cruciaal om de hoogst mogelijke hygiëne te handhaven. Waar mogelijk werken onder steriele omstandigheden. 1. Voorbereiding van de Injectie / Recording System Steriliseer de buis die de micropipet verbindt met de spuit. Gebruik de kortste lengte van de buis mogelijk in de experimentele set-up tussen de injectiepomp en elektrofysiologische opname systeem. Reinig de geleidingsbuizen van de opname-systeem met behulp van reiniging draden. Dompel ze in steriele siliconenolie en voeden hen door de afzonderlijke geleidebuizen meerdere malen. Steek het kwartsglas micropipet in een geleidingsbuis van het opnamesysteem. Zie figuur 1A. Na vaststelling van de micropipet inhet opnamesysteem, bevestig de steriele buis naar de metalen pin van de micropipet. Wees voorzichtig; hoewel de micropipet in het systeem wordt vastgesteld kan gemakkelijk breken bij het bevestigen van de buis. Gebruik twee steriel pincet om gelijke druk uit te oefenen op de pin en de buis. Vloeibare super lijm op de kruising tussen de buis en micropipet af te dichten. Wacht tenminste 3 uur voor de lijm uitharden alvorens het vullen van de micropipet met vloeistof. Invoegen micro-elektroden (bijvoorbeeld kwarts glas geïsoleerde platina wolfram) in andere standen van het opnamesysteem voor of na het inbrengen micropipet. 2. De voorbereiding van de chemische stof Steriliseren 1,5 ml microcentrifugebuizen voor latere opslag van injectieoplossingen gebruik van een autoclaaf of andere betrouwbare procedure. Weeg de bijbehorende stof scopolamine hydrochloride tot 5 ml van een 0,1 molaire oplossing te bereiden. Oplossen in steriele zoutoplossing (0,9% NaCl). Onder steriele omstandigheden ina zuurkast, filteren de oplossing met behulp van een injectiespuit filter met een voldoende grote poriën diameter, bijvoorbeeld 0,2 urn. Onder de zuurkast aliquot de oplossing in hoeveelheden voldoende voor een enkel experiment, bijvoorbeeld voor scopolamine, 500 pl in steriele 1,5 ml microcentrifugebuis. Gebruik donkere buisjes om de stof te beschermen tegen het licht; als alternatief, wikkel tubes in aluminiumfolie. Voor scopolamine Bewaar de oplossing tot 14 dagen bij 4 ° C. 3. Dagelijks Voorbereiding van de Injectie / Recording System Opmerking: Bij montage in het opnamesysteem, worden de elektroden en micropipet opgeslagen in een enzymoplossing (Tergazyme, 1% oplossing met gedeïoniseerd water) tussen opnames. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd voor elke opname. Verzamel een buis van de te injecteren substantie. Laat het RT bereiken als gekoeld. Verwijder de injectie / opnamesysteem van de enzymoplossing en spoel elektrodenen micropipet met gedeïoniseerd water om volledig schoon enzymoplossing. Verwijder de voorkant van het opnamesysteem om visueel te controleren de afdichting tussen micropipet en de buis. Toepassen steriele siliconenolie aan de geleidebuis spleet (zie figuur 1A) en de uiteinden van de elektroden en micropipet om het systeem te smeren voor soepele bewegingen. Controleer tips van de elektroden en micropipet met behulp van een microscoop te zorgen dat ze intact zijn. Lijn de elektroden en de micropipet onder de microscoop, zodat ze uit de geleidebuizen uitbreiden dezelfde lengte. Drijf ze in de geleidingsbuizen, zodra zij niet meer toegankelijk te stoppen. Hieronder wordt verstaan ​​elektrodepositie nul. Stel de diepte van de elektroden en micropipet aan 0 in de software. Vul een steriele spuit met een steriele zoutoplossing en steek de naald in de buis, het verzorgen van de wand van de buis niet te doorboren. Rij de micropipet uit de geleidebuis voor visual controle van de stof flow. Spoelen tenminste 2 ml steriele zoutoplossing door de buis en micropipet geen lucht waarborgen in de spuit of in de buis. Niet te veel druk niet op de zuiger van de spuit. Zorg ervoor dat de verbinding tussen buis en micropipet is verzegeld. Als lekkage zichtbaar is, re-lijm de splitsing (zie stap 1.5) en de opname uit te stellen. Vul een nieuwe steriele spuit met de oplossing te injecteren en uitwisseling met de loop van de zoutoplossingspuit, dat wil zeggen, houdt de naald van de spuit met zoutoplossing in de buis. Zorg ervoor dat er geen lucht wordt overgedragen in het systeem. Dit wordt het best bereikt door het vullen van de naaldnaaf met zoutoplossing na verwijdering van de zoutoplossing gevulde vat. Spoel het systeem met 250 ul van de oplossing te injecteren, om de zoutoplossing uit de buis te verwijderen. Met de motor besturingssoftware intrekken elektroden en micropipet in de guidetubesto een diepte van ten minste -500 urn. <li> Laat de geleidebuis ring (Figuur 1A) naar de bodem van de geleidingsbuizen hun vaste relatieve positie te handhaven. Reinig de basis van het systeem met ethanol, in het bijzonder wanneer de aap opname kamer zal raken. Sluit het opnamesysteem door het vervangen van de voorklep en de schroeven. 4. Validatie van het injectiesysteem Let op: Hoewel het bedrijf kalibreert het systeem, is het raadzaam om de uitgeworpen volumes met de gebruikte in de experimentele set-up (buizen, spuiten enz.) Materialen te valideren. Bereid het systeem zoals beschreven in stap 3, waarbij elektroden en micropipet uitgebreid uit de geleiding buizen. Een diepte van tenminste 7000 urn wordt geadviseerd om verlies van meetvolume voorkomen door hechting langs het buitenoppervlak van de micropipet en de elektroden. Plaats het opnamesysteem op de plaats zal worden gebruikt tijdens het experiment en zet de syringe in de micro-injectie pomp. Bevestig de spuit op zijn plaats met behulp van de rubberen band en verstelbare grip (zie figuur 1A). Schuif het beweegbare deel van de pomp totdat deze stevig op zijn plaats achter de zuiger van de spuit. Met behulp van de software-gestuurde motor-eenheid, werpen een volume groot genoeg is om nauwkeurig te meten, bijv., 1000 nl. Het verdient de voorkeur een enkele stap om het totale volume te werpen om de effecten van capillaire werking langs de micropipet oppervlak voorkomen. Zeer lage snelheden (1 nl / s) kan ook leiden tot dit effect tijdens de validatieprocedure. Verzamel het totale volume in een bak onder de micropipet geplaatst, of zorgvuldig direct verzamelen van de uitgeworpen daling van de punt van de micropipet. Schat de uitgeworpen volume met behulp van een pipet of door weging, met een precisieweegschaal. Herhaal deze procedure een paar keer om metingen te bevestigen. 5. Acute Recordings Stel de xy positievan het opnamesysteem. Dit bepaalt het punt waarop de geleidebuizen bereikt de dura mater binnen de chronisch geïmplanteerde opname kamer. Zorg ervoor dat de gids buizen zijn volledig ingeschoven (geleidebuis z stand 0). Breng het opnamesysteem in positie en plaats de spuit in de micro-injectie pomp. Bevestig de spuit op zijn plaats met behulp van de rubberen band en verstelbare grip (zie figuur 1A). Schuif het beweegbare deel van de pomp totdat deze stevig op zijn plaats achter de zuiger van de spuit. Als een druppel stof zichtbaar aan het uiteinde van de geleidingsbuizen voorzichtig verwijderen met een steriel wattenstaafje. Bereid het dier voor het opnemen volgens de procedure van het laboratorium (zie 18 bijvoorbeeld richtlijnen). Te monteren de opname-systeem op de opname kamer van de aap. Langzaam handmatig de geleidebuizen laten zakken in de opname kamer tot de dura wordt bereikt, dan rijden de elektroden met behulp van de motor control software. Aangezien het niet mogelijk is de impedantie van de micropipet meten rijden eerst met elektroden en controleren hun impedanties regelmatig op verschillende diepten. Na penetratie van de dura met succes wordt uitgevoerd zonder beschadiging van de elektroden vooraf de micropipet. Rij de elektroden en de micropipet de doelelektrode diepte waarop het hersengebied plaats wordt verwacht worden. vooraf langzaam de elektrode totdat deze dicht genoeg bij de activiteit van een eenheid op te nemen, zoals blijkt uit een goede signaal-ruisverhouding in het opgenomen signaal. Belangrijker plaats de registratie-elektrode en de micropipet op dezelfde diepte om de minimale afstand tussen elektrode en micropipet waarborgen. Indien mogelijk, houdt de elektroden en micropipet op deze diepte voor de gehele opname. Indien de enige manier om de signaalkwaliteit van de geregistreerde-cel is met de elektroden bewegen, dan rijdt de elektroden en de micropipettegelijkertijd de afstand tussen hen te handhaven. 6. Ruimtelijke Aandacht Task In een reeks proeven onderhavige twee bewegende puntpatronen op het scherm, een gepositioneerd in het receptieve veld van de opgenomen neuron en andere daarbuiten, alsmede een centraal gepresenteerde bevestigingspunt dat het dier moet foveate in elk proces 19, 20. Opmerking: De aap is getraind om te reageren op een verandering van richting in de cued dot patroon (het doel event), terwijl het negeren van elke richting overgaand in de andere dot patroon, en wordt beloond met een druppel vloeistof voor elke succesvolle afronding van een proef 19, 20. Als een zintuiglijke controle conditie, de aap heeft een luminantie verandering van de fixatie te melden terwijl het negeren van zowel bewegende stip patronen (zie figuur 2 voor een meer gedetailleerde beschrijving van de taak). 7. Farmacologische Manipulatie tijdens het opnemen <p> Let op: Terwijl de aap is het uitvoeren van de taak, injecteer de stof in een bloksgewijs manier. Drie opeenvolgende blokken gedefinieerd: controle, die fungeert als basis; injectie, waarbij een stof wordt uitgestoten; en herstel, waarbij de cellen waarop het injectie terugkeer naar de basislijn. Tijdens een injectieblok injecteren een vooraf bepaalde hoeveelheid van de stof regelmatig bv., 2 nl elke minuut met een snelheid van 2 nl / s. Voor dit voorbeeld gebruiken scopolamine hydrochloride. Het injectieproces wordt via software die verscheidene opties biedt. Gebruik bijvoorbeeld de stap functie aan de injectie volume te definiëren, en druk op de knop injectie elke minuut op basis van de klok van de opname software. Opmerking: De exacte duur van de injectieblok substantie en experiment afhankelijk, bijvoorbeeld voor gebruik scopolamine 2 nl injecties per minuut gedurende 10 min (20 nl in totaal).. Het verdient de voorkeur de elektroden en micropipet duri niet om door te gaanng van de injectie blok. Noteer de tijd en het proces waarin de stof wordt geïnjecteerd, de diepte van de elektroden en micropipet, en de hoeveelheid uitgestoten stof. Volg de injectieblok een herstel blok, waarin geen substantie geïnjecteerd. De duur van het herstel blok stof specifiek en moet worden gedefinieerd in de pre-testen. Bewaken en de opnamekwaliteit van de geselecteerde afzonderlijke eenheden handhaven tot het einde van de herstelperiode blok. Herhaal de drie blokken voor zo lang als de opname kwaliteit en motivatie van de aap mogelijk te maken. 8. Bericht Opname Procedures Na de registratie van de gegevens, in te trekken elektroden en micropipet in de geleiding buizen en vervolgens handmatig de geleidebuizen trekken. Verwijder de opname-systeem van de opname kamer van de aap. Maak de spuit uit de inspuitpomp en het systeem dragen aan de bereidingsruimte te reinigen. Behandel het dier(inclusief reinigen van de opname kamer 18) volgens de standaard procedures van het laboratorium en terug naar de behuizing faciliteit. Spoel de buitenzijde van de geleidingsbuizen met waterstofperoxide (3%) en vervolgens met gedeïoniseerd water. Drive elektroden en micropipet uit de geleiding buizen, spoelen met waterstofperoxide en vervolgens gedemineraliseerd water. Wisselen de cilinder van de spuit met een cilinder van een injectiespuit gevuld met steriele zoutoplossing, waarbij de naald in de buis. Spoel de buis en de micropipet met 1-2 ml zoutoplossing. Na het spoelen, verwijder dan het vat en vul deze met lucht. Plaats het vat in de naald en droog de buis en de micropipet van binnenuit diept lucht door. Bewaar de geleidingsbuizen uitgebreid elektroden en micropipet ondergedompeld in de enzymoplossing om uitdroging te voorkomen en om de afbraak van organisch materiaal te waarborgen.