깨어되는 행동 원숭이 원숭이 코어 텍스에서 정보 처리의 신경 약리학 조사에 대한 압력 분사 시스템
Summary
Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.
Abstract
The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.
Introduction
In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine1. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies2, as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals3 and systemic pharmacological manipulations in humans4. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems5,6 and can lead to changes in neural activity3.
Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug7. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules8, correlating with the tip diameter9 of the micropipette as well as with the concentration8 of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used10, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.
Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley11 for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain12) to a defined brain area13 while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette13. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly14 and intracellularly15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see17 for a comparison of recent pressure injection systems).
An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.
The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 "기성품"압입 시스템을 안정적이고 정확한 주사 고품질 단일 셀 녹화를 수행하는 방법을 상세히 설명 하였다. 약물 전달이 방법은 이전에 (17 평가) 원숭이 행동에 이용되었지만, 여기에 제시된 시스템 아래 검토 장점을 갖는다.
도 4a에 도시 된 바와 같이, 여기에 설명 된 시스템과, 기록 위치의 바로 근방의 약물 주입없이 단일 신경 세포 활성의 측정을 안정적으로 제공 할 수있다. 도 4b에 도시 된 바와 같이, 대조 물질, 생리 식염수의 주입은, 소성 속도의 변화로 이어질 않았다. 이 컨트롤은 사출 공정 자체가 기록 된 뉴런의 소성 측정 가능한 특성에 영향이 없음을 보여준다.
뉴런 기록 전극과, 마이크로 피펫의 공간적 구성은 매우 중요하다 이 실험의 중요성. 촬영하는 동안 조직에서의 상대적 위치의 정확한 측정이 불가능하지만, 우리는 고려하고 분산 가능한 소스 제어 할 수 있습니다. 첫째, 주입 부피 중에 관심 뉴런 기록 신호의 안정성에 영향을 미치는, 기록 전극으로부터 멀리 변위 될 우려가있다. 그 이유는 이전에 신호의 안정성을 확인하기 위해 분사 블록 후 소성 속도를 비교 신중하다. 둘째, 기록 시스템의 가이드 튜브 구성은 마이크로 피펫 전극 사이의 거리를 정의 (예.,이 실험에 사용 된 동심의 3 채널 시스템에서 305 μm의). 시스템 조직의 전극과 마이크로 피펫의 깊이에 대한 정밀한 위치 제어를 제공하기 때문에, 이들 사이의 거리가 신중하게 (단계 3.5에게) 기록하기 전에 상대 깊이를 보정하고, 녹화 중에 공통 깊이들을 유지함으로써 최소화 될 수있다.
엔트 "> 잠재적 인 제한제조사 내부 품질 관리에 더하여, 시스템은 튜브의 다른 브랜드로 실험실 조건에서 검증 될 필요가 주사기 등이 사용될 수 있고, 토출 양의 차이가 발생할 수있다. 시스템은 여기에 도시 된 실험에서 매우 소량을 주입하는데 사용될 수 있지만, 이들은 정상적인 실험실 환경에서 실제 측정 한계로 인해 확인 될 수있는 최소한의 양 이하이다. 그러나,보다 큰 주입량은 소프트웨어 정의 된 볼륨 하드웨어 토출 용적의 관계를 추측 할 수있다. 투명한 튜브를 사용하는 경우, 사출 공정의 추가 비주얼 검사 시각적 마커의 변위를 측정 할 수있다.
마이크로 피펫의 직경이 약간 큰 재료와 더 깨지기으로 시스템에 마이크로 피펫을 삽입하면, 전극 삽입보다 더 요구된다. 게다가,이 마이크로 피펫의 상단 부분이 파손될 위험을 수반로서 마이크로 피펫의 핀 튜브를 접합하는 것은 어려운 것이다. 그러나, 성공적으로로드 마이크로 피펫의 수명은 심지어 매일 사용하여, 수개월이다.
실제로, 우리는 아직 시스템의 포스트 레코딩 동안 세정 분사 시스템의 차단을 발생하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 어떤 "온라인"검사가 불가능하고, (예컨대, 마이크로 피펫 팁의 조직과 같은) 물리적 방해물이 물질을 주입하지 못할 수있는 위험이있다. 따라서 이러한 실험의 제어 및 주입 블록 사이의 요금 발사에 상당한 변화를 보여 추가 분석에서 만 셀을 포함하는 것으로, 보수적으로 데이터를 분석하는 것이 좋습니다 수 있습니다.
그들의 작은 직경에도 불구하고, 미소 전극과 피펫은 뇌 조직을 대체하고 일부 지방 조직 손상의 원인이 될 수 있습니다. 이것은 수동 번째의 팁을 위치시킴으로써 최소화 될 수있다다만 경막 위의 전자 안내 관. 전극은 경질 침투 및 intactness는 온라인으로 임피던스를 측정하여 추정된다. 그 후, 마이크로 피펫이 삽입됩니다. 이 방법을 사용할 때, 상기 경질 조직의 규칙적인 제거는 상기 전극 피펫 또는 파손의 위험을 최소화하기 위해 추천된다.
다른 방법에 비해
여기에 사용 된 시스템은 다른 압력 분사 시스템에 비해 분명한 장점을 나타낸다. 하나의 강력한 이점은 가능한 다른 프로브 (17)의 절반 크기 인 마이크로 피펫 (약 100 μm의)의 직경이고, 따라서 신경 조직의 손상을 최소화한다. 이전의 설계와 대조적으로, 현재의 시스템은 공간적으로 기록 전극과 마이크로 피펫을 분리 이용한다. 다른 시스템 전극과 피펫 사이의 작은 거리를 제공하지만, 여기에 설명 된 시스템은 전극과 피펫, 따라서 permi의 독립 깊이 변경을 할 수 있습니다기록 세션 내의 상대 거리를 가변 tting. 분사 시스템이 구축 기록 장치의 연장이기 때문에 중요한 녹화 품질 대한 타협이 이루어질 필요가 없다. 하나의 마이크로 피펫 따라서 하나의 물질이 프로토콜에서 사용되는 반면, 하나의 실험 절차 내에 여러 물질을 주입 할 수있다. 이를 위해 여러 가지 마이크로 피펫 별도의 안내 관에 나사 개별 분사 펌프에 장착 된 주사기에 연결될 수있다. 하나의 컴퓨터 프로그램은 전극 및 마이크로 피펫을 진행하고, 실험 기간 동안 압력 분사를 수행하는데 필요한 마지막으로, 시스템을 제어하는 것은 용이하다.
이온 삼투압에 압입 비교 상대적인 장점과 단점이있다. 예를 들면, 압입, 따라서 신경 변위의 위험을 증가시키는, 이온 삼투압보다 조직에 도입하는 큰 부피를 필요로한다. 현재 프로토COL은 내셔널 리그 범위에서 볼륨을 사용하고, 우리는 거의 기록 세포의 신호 품질에 눈에 띄는 변화를 경험하지. 이 시스템은 또한 행동 조작에 대한 잠재적으로 유용하지만 신경 기록의 안정성에 영향을 미칠 수있는 더 큰 볼륨을 주입 할 수 있습니다. 충전 물질을 사용 할 필요가 없기 때문에 이온 삼투압 이상의 압력 분사의 분명한 이점은 유용한 물질을 더 다양하다. 그러나, pH 값을 체크해야하며, 실험 및 제어 물질을 비교 (예., 식염수).
문제는 신경 활동을 조작하는 등 optogenetics 대신에 새로운 기술의 가압 주입의 전통 방법을 사용하는 이유를 발생할 수있다. 잘 설치류 년에 설립했지만, optogenetics은 아직 확실하게 붉은 털 원숭이 년에 설립되어 있지 않습니다. 특히, 또 특정한 신경 전달 물질에 대한 선택적 세포 유형의 로컬 조작을 허용하지 않는다. 긴 안목으로 보면, 우리는 참조인지 기능의 신경 기초를 해명에 optogentic 조작의 장점과 약리 조작의 장점의 조합에 대한 큰 잠재력.
여기에서는 압력 주입 붉은 털 원숭이 행동 약리학 깨어 뇌 국소 제한 지역을 조작하는 방법을 도시하고있다. 우리는이 방법은 신경 활동의 역학에 neuromodulatory 기여를 조사하기 위해 다른 과학자들에게 영감을 바랍니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 ST가 "감각 처리의 셀룰러 메커니즘"공동 연구 센터 889 (프로젝트 C04)를 통해 독일 연구 협회의 보조금에 의해 지원되었다. 우리의 기술 지원을, 독일 영장류 센터, 박사 카타리나 Debowski 안나 Magerhans의 줄기 세포 단위에서시나 플러머, 레오노레 Burchardt, 더크 Prüsse, 클라우스 Heisig 기술 및 동물 관련 지원 랄프 Brockhausen 우리의 협력자 감사합니다 여과 공정.
Materials
| (-)-Scopolamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 55-16-3 | Mr 339.81 g/mol |
| NaCl 0.9% | B. Braun Melsungen AG | 3079870 | 5ml |
| Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | enzyme detergen |
| Hydrogen peroxide | Roth | Used in 3% solution with deionized water | |
| Ethanol | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
| Deionized water | |||
| Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | Syringe and needle |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
| Quarzglass micropipette | Thomas Recording | ||
| Recording electrode | Thomas Recording | quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ and 0.3-0.5 MΩ | |
| PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain Performance Plastics | 3702003 | Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm) |
| Loctite 401 | Henkel | 233641 | Superglue |
| Silicon oil | Thomas Recording | M-1000 | |
| Minisart RC15 | Sartorius | 17761———-R | Syringe filter |
| Multichannel Micro Injection System | Thomas Recording | multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump | |
| McLab | custom | internal lab software to control stimulus presentation |
References
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