Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.
The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.
O rim é essencial para a homeostase dos fluidos, regulação da pressão arterial e filtragem de resíduos do corpo. Embora os mamíferos são capazes de reparar néfrons existentes após a lesão usando células epiteliais diferenciadas 1-4, eles parecem não ter um pool de células-tronco reservadas 5 e são incapazes de formar novos néfrons de novo. Em contraste com os mamíferos, peixes adultos são capazes de formar novas nefrónios ao longo da vida adulta para apoiar o crescimento dos peixes e, em resposta a uma lesão 6,7. O peixe-zebra, Danio rerio, é um organismo modelo de valor inestimável para o estudo da regeneração de órgãos 10/08 e tem o potencial de fornecer insights poderosos em aplicações de engenharia a reparação de rins humanos. A Tg (Lhx1a: EGFP) transgene 11 foi mostrado para identificar um conjunto de células progenitoras no nefrónio do rim adulto zebrafish 12, no entanto, os mecanismos que controlam a resposta de células lhx1a + para r lesãoemain claro.
A gentamicina é um antibiótico aminoglicosídeo amplamente utilizado com efeitos nefrotóxicos e ototóxicos conhecidos em humanos 13. Injeção intra-peritoneal de gentamicina é um método estabelecido de induzir lesão renal aguda em peixes 6. Esta lesão em peixes imita a perda de epitélio tubular e cicatrizes de glomérulos que ocorre em seres humanos após overdose de gentamicina 14. Indução de lesão no peixe-zebra por injecção de gentamicina é uma maneira conveniente de induzir uma resposta forte de regeneração, síncrona, com muitas novas nefrónios produzidos e procedendo em simultâneo através de estágios de formação, diferenciação e proliferação.
Este protocolo detalhes o nosso método de lesão robusta e reproduzível no peixe-zebra rim adulto, utilizando um processo de triagem visual não invasivo para minimizar valores atípicos. Nós tirar proveito do facto de que a lesão com gentamicina leva à morte do tecido renal epitelial e formatoion de moldes tubulares renais, que depois se acumulam em massas nas condutas mesonéfricos e cloaca. Estes são passados pelos peixes e pode ser observada visualmente na água. Isto permite-nos para triagem de peixe com forte lesão não-letal, que pode então ser combinadas para fazer novas experiências. Minimizando o número de peixes ou peixe ileso que morrem antes de chegar ao ponto final do experimento leva a mais uniforme e eficiente de coleta de dados e análise. Além disso, não são necessários dispositivos especiais ou reagentes, tornando este método custo-efetivo e adequado para uso em um ambiente acadêmico ou de ensino. Utilizando o nosso método, aqui mostram os efeitos de doses crescentes de gentamicina sobre a regeneração do rim, assim como o efeito do aumento da temperatura.
O peixe-zebra é ideal para estudar a regeneração de órgãos adultos, incluindo o rim adulto mesonephric 6. Estudos recentes têm se aproveitado de marcadores moleculares e novas linhas repórter transgénico para melhor caracterizar as etapas que ocorrem durante a regeneração de néfrons e quais as células podem ser responsáveis 7,12. Observação de cilindros urinários foi usado para mais de um século, para diagnosticar a doença renal em seres humanos 16. Aqui usamos a …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately |
30G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1xPBS for working solution |