Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung
Summary
Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.
Abstract
The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.
Introduction
Die Niere ist für die Flüssigkeit Homöostase, Blutdruckregulation und Filtration von Abfall aus dem Körper. Obwohl Säugetiere sind in der Lage, bestehende Nephrone nach Verletzung mit differenzierten Epithelzellen 1-4 reparieren, scheinen sie einen Pool von reservierten Stammzellen 5 fehlt und sind unfähig, neue Nephrone de novo bilden. Im Gegensatz zu Säugetieren, sind erwachsene Fische können neue Nephronen während des Erwachsenenlebens zu bilden, um das Wachstum der Fische und in Reaktion auf eine Verletzung 6,7 unterstützen. Der Zebrafisch, Danio rerio, ist ein unschätzbares Modellorganismus für das Studium der Organregeneration 8-10 und hat das Potenzial, leistungsstarke Einblicke in die Anwendungen für Engineering der Reparatur von menschlichen Nieren zu schaffen. Die Tg (Lhx1a: EGFP) Transgen 11 ist gezeigt worden, um einen Pool von Nephron-Vorläuferzellen im erwachsenen Zebrafisch Nieren 12 kennzeichnen jedoch Mechanismen, die die Reaktion der lhx1a + Zellen verletzungs rEmain unklar.
Das Aminoglycosid Gentamicin ist ein häufig verwendetes Antibiotikum mit bekannten nephrotoxischen und ototoxic Wirkungen bei Menschen 13. Intraperitoneale Injektion von Gentamicin ist ein etabliertes Verfahren zur Induktion der akuten Nierenschädigung in Fisch 6. Diese Verletzung in Fisch imitiert den Verlust von Tubulusepithel und Vernarbung der Glomeruli, die nach Gentamicin 14 Dosierung beim Menschen auftritt. Induzieren Schädigung im Zebrafisch Refobacin Injektion ist ein bequemer Weg induzieren eine starke, synchrone Regenerierung Reaktion mit vielen neuen Nephronen erzeugt und gleichzeitig durch die Stufen der Bildung, Proliferation und Differenzierung fortfahren.
Dieses Protokoll Details unserer Verfahren für robuste und reproduzierbare Verletzung im erwachsenen Zebrafisch Niere durch die Verwendung eines nicht-invasiven bild Screening-Prozess, um Ausreißer zu minimieren. Wir nutzen die Tatsache, dass Verletzungen mit Gentamicin führt zum Tod von epithelialen Nierengewebe und FormatIon der Nierentubuli Abgüsse, die dann in Massen sammeln sich in den Mesonephros Kanäle und Kloake. Diese werden durch den Fisch geführt und kann visuell im Wasser beobachtet werden. Dies erlaubt uns, für Fische mit stark nicht-tödliche Verletzungen, die dann für weitere Experimente gebündelt werden können screenen. Minimierung der Zahl der unverletzten Fische oder Fische, die vor Erreichen der Endpunkt des Experiments führt zu mehr einheitliche und effiziente Datenerfassung und -analyse zu sterben. Darüber hinaus sind keine speziellen Geräte oder Reagenzien erforderlich, so dass diese Verfahren kostengünstiger und geeigneter für die Verwendung in einem akademischen oder Lehr Einstellung. Mit unserem Verfahren, hier zeigen wir die zunehmenden Auswirkungen von Gentamicin-Dosis auf die Nierenregeneration sowie die Wirkung der erhöhten Temperatur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Zebrafisch ist ideal für das Studium der Regeneration von erwachsenen Organen, einschließlich der erwachsenen Niere Mesonephros 6. Jüngste Studien haben den Vorteil von molekularen Markern und neuen transgenen Reporter Linien besser zu charakterisieren die Schritte, die während Nephron Regeneration auftreten und welche Zellen verantwortlich 7,12 sein könnten. Beobachtung Harnzylinder ist seit über einem Jahrhundert verwendet, um Nierenerkrankungen beim Menschen 16 zu diagnostiz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1xPBS for working solution |
References
- Humphreys, B. D., et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Humphreys, B. D., et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).
- Guo, J. K., Cantley, L. G. Cellular maintenance and repair of the kidney. Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).
- Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult. Pediatr Nephrol. , (2013).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Dev Biol. 320, 161-174 (2008).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2011).
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , (2011).
- Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day. Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).
- Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling. Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).
- Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).
- Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).
