Почки Регенерация у взрослых данио рерио по гентамицина поражении
Summary
Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.
Abstract
The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.
Introduction
Почек имеет важное значение для гомеостаза жидкости, регулирования артериального давления и фильтрации отходов из организма. Хотя млекопитающие способны отремонтировать существующие нефронов после травмы, используя дифференцированные эпителиальные клетки 1-4, они, кажется, не хватает бассейн зарезервированных стволовых клеток 5 и не в состоянии сформировать новые нефронов De Novo. В отличие от млекопитающих, взрослые рыбы способны образовывать новые нефронов на протяжении всей взрослой жизни, чтобы поддержать рост рыбы и в ответ на повреждение 6,7. Данио, Danio rerio, является бесценным модельный организм для изучения регенерации органов 8-10 и имеет потенциал, чтобы обеспечить мощные идеи в приложения для проектирования ремонт почек человека. Tg (Lhx1a: EGFP) трансгенной 11 было показано, что метка пул клеток-предшественников нефрона в почках взрослых данио 12, однако механизмы, контролирующие реакцию lhx1a + клеток на повреждение REmain неясно.
Аминогликозид гентамицин широко используется антибиотик с известными нефротоксических и ототоксичных воздействия на человека 13. Внутрибрюшинное инъекции гентамицина установлено методом индукции острого повреждения почек у рыб 6. Эта травма в рыбных имитирует потерю эпителия канальцев и клубочков рубцов, что происходит в организме человека после передозировки гентамицин 14. Стимулирование травмы у рыбок данио по гентамицин инъекции удобный способ вызывать сильное, синхронный ответ регенерации, со многими новыми нефронов, производимых и одновременно исходя через этапы формирования, пролиферации и дифференцировки.
Этот протокол детали наш метод для надежной и воспроизводимой травмы во взрослом данио почки с использованием неинвазивного визуальный процесс отбора, чтобы минимизировать выбросы. Мы воспользоваться тем, что травмы с гентамицином приводит к смерти эпителиальной ткани почек и форматион почечных канальцев отливок, который затем накапливаются в массы в мезонефрические протоков и клоаки. Они передаются от рыбы и может быть визуально в воде. Это позволяет для скрининга рыбы с сильным несмертельного травмы, которые затем могут быть объединены для дальнейших экспериментов. Минимизация числа неповрежденной рыбы или рыбы, которые умирают, не дожив до конечной точки эксперимента приводит к более равномерному и эффективному сбору и анализу данных. Кроме того, никаких специальных устройств или реагенты не требуются, что делает этот метод экономически эффективным и подходящим для использования в учебном или преподавательской обстановке. Используя наш метод, здесь мы показываем возрастающие эффекты гентамицина дозы на регенерацию почек, а также влияние повышенной температуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данио идеально подходит для изучения регенерации взрослых органов, включая взрослых мезонефрические почек 6. Недавние исследования воспользовались молекулярных маркеров и новых трансгенных линий репортер лучше характеризуют действия, которые происходят во время регенерации ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1xPBS for working solution |
References
- Humphreys, B. D., et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Humphreys, B. D., et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).
- Guo, J. K., Cantley, L. G. Cellular maintenance and repair of the kidney. Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).
- Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult. Pediatr Nephrol. , (2013).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Dev Biol. 320, 161-174 (2008).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2011).
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , (2011).
- Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day. Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).
- Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling. Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).
- Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).
- Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).
