Um método cirúrgico é descrito para expor o crânio ventral em ratos recém-nascidos. Usando essa abordagem, é possível abrir uma craniotomia para realizar eletrofisiologia aguda e experimentos de microscopia de dois fótons no tronco encefálico de filhotes anestesiados.
O uso de uma craniotomia para experiências in vivo, oferece a oportunidade de investigar a dinâmica de diversos processos celulares do cérebro de mamíferos em idade adulta e durante o desenvolvimento. Embora a maioria das abordagens in vivo utilizar uma craniotomia para estudar as regiões do cérebro situadas no lado dorsal, as regiões do tronco cerebral, tais como a ponte, localizadas no lado ventral permanecem relativamente pouco estudado. O principal objetivo deste protocolo é facilitar o acesso às estruturas do tronco cerebral ventral, para que possam ser estudados in vivo utilizando eletrofisiológico e métodos de imagem. Esta abordagem permite o estudo de mudanças estruturais no axônios de longo alcance, os padrões de atividade elétrica em único e conjuntos de células, e as alterações na permeabilidade da barreira sanguínea do cérebro em animais recém-nascidos. Embora este protocolo tem sido usado principalmente para estudar o tronco encefálico em ratos recém-nascidos, ele pode facilmente ser adaptado para estudos em outras espécies de roedores, como ratos neonatos, adultos rodents e de outras regiões do tronco cerebral.
O uso de uma craniotomia em combinação com imagens de fluorescência e técnicas de monitorização de electrofisiologia permite o fluxo sanguíneo, permeabilidade da barreira hemato-encefálica e medição da actividade de neurónios e células da glia em animais vivos 1-3. Vários laboratórios têm usado essa abordagem para fornecer informações sobre a fisiologia do cérebro em condições saudáveis e de doença, mas subsistem lacunas em nossa compreensão de como esses processos surgem durante o desenvolvimento. Além disso, a maioria dos estudos têm-se centrado em regiões do cérebro que são facilmente acessíveis a partir da superfície dorsal do crânio, de tal forma que as estruturas do tronco cerebral ventrais com diversas funções fisiológicas têm sido estudados principalmente utilizando abordagens ex vivo.
O principal objetivo deste protocolo é fornecer um método para abrir uma craniotomia no crânio ventral de roedores. Esta abordagem foi adaptada a partir de estudos clássicos realizados em mamíferos de grande porte, tais como cães e gatos para reco neurofisiologia sensoriaisrdings do tronco encefálico 4-7. Neste protocolo no entanto, não é o novo desafio de realizar o procedimento em animais recém-nascidos. Usando marcos vasculatura, este protocolo adaptado tem sido usado anteriormente para estudar o tronco encefálico de ratos neonatos, camundongos adultos e de outras regiões do tronco cerebral, como o verde-oliva inferior 8-11 (Figura 1).
A principal vantagem de uma craniotomia ventral sobre os métodos existentes para estudar núcleos do tronco cerebral ventral é que ele fornece acesso direto às estruturas de interesse em animais vivos. Por exemplo, as células auditivas do complexo olivar superior estão localizadas a algumas dezenas de micrómetros a partir da superfície do cérebro, o que é importante para a colocação de sondas alvo e para a utilização de métodos de imagiologia de dois fotões, em que a profundidade da imagem pode ser limitada a 0,5 mm x espalhamento de tecido leve e absorção. A craniotomia ventral também proporciona uma preparação com conexões neurais relativamente intactas, which são interrompidos em preparações fatia organotípicas agudas e 12. Em contraste com outros protocolos para experimentos in vivo neurofisiologia 13, uma abordagem ventral pode ser combinada com a gravação multi-eletrodo e métodos de imagem que fornecem informações sobre conjuntos celulares (figuras 6 e 7). Por último, em combinação com este protocolo um soluto marcado por fluorescência pode ser injectado no sistema vascular para medir alterações na permeabilidade da barreira hematoencefálica para o soluto (Figura 8).
O tempo é crítico. Um pesquisador experiente deve ser capaz de completar este protocolo em 1 hora (passos 1-3). Os tempos indicados para as diferentes etapas pressupõem um médio a alto nível de especialização. Traqueostomia e intubação adequada e atempada são fundamentais, uma vez pobre controle de ventilação pode levar à asfixia e morte do animal. Folga cuidadosa dos tecidos musculares e de gordura também é muito importante porque os erros podem levar a hemorragia descontrolada e morte do animal. Da mesma forma, quando se prepara a artéria carótida para a inserção da cânula, é preciso apertar e cortar a artéria com cuidado, se o nó fio fica solto hemorragia descontrolada ocorrerá. Por fim, a craniotomia deve ser feita com cuidado, sem interromper os marcos vasculatura. Remoção Careless da camada meníngea externo (dura) pode levar a hemorragia grave e danos do suprimento arterial.
Configurações de ventilação são escolhidos de acordo com a idade do animal.A maioria dos fornecedores comerciais fornecer informações úteis sobre essas definições. Experimentos em ratos mais velhos do que P15 vai exigir o uso de um grande ventilador animal. Os animais adultos podem não precisar de ventilação se anestesiados com cetamina / xilazina, mas intubação é recomendado para evitar fluido entrar na traquéia.
Uma das principais limitações deste protocolo é que as experiências só podem ser realizadas de forma aguda. Em nosso laboratório temos realizado experimentos com duração entre dois e até dez horas. Uma segunda limitação é que as experiências devem ser realizadas sob anestesia. Portanto, a escolha do anestésico é uma variável importante a ser considerado no planejamento e projeto de experimentos. Uma questão relacionada é que os animais recém-nascidos podem ser particularmente sensíveis a uma overdose. Por exemplo, se a escolha de cetamina / xilazina mix, calcular a dose com base no peso do filhote e administrar medicamentos a ⅓ do volume máximo. Verifique o estado do animal a cada 5-10 minutos por toe pitada resposta. Se estiver usando o isoflurano, as precauções também são necessárias para manter um ambiente seguro para o investigador (ventilação adequada e um vaporizador calibrado corretamente).
A lupa pode ser montado em um suporte flexível para ajustar o ângulo de visualização e facilitar o desembaraço de espaço para colocar eletrodos e deslocalização do animal ao microscópio de dois fotões. A utilização de uma bateria para alimentar o ventilador pode facilitar a movimentação do animal e reduzir artefatos elétricos durante experimentos de eletrofisiologia. Para este fim, uma pequena placa de ensaio (7,5 x 12 polegadas) pode ser utilizado para montar o conjunto do ventilador, a almofada de aquecimento e animais anestesiados (Figura 2a). Uma modificação útil e importante para esta configuração é a adição de um dispositivo para a monitorização de sinais vitais durante a cirurgia. Um oxímetro ou outros dispositivos analógicos podem ser usados, dependendo do orçamento de laboratório.
Este protocolo tem sido utilizado com eletrofisiologia e imagem conhecicochos, incluindo gravações de patch braçadeira 8,10,11, gravações polytrode (Figura 7), e de dois fótons de imagem 9 (Figuras 6 e 8). Uma possível aplicação futura seria combinar esses métodos para direcionar células marcadas com fluorescência para a gravação eletrofisiológico 16.
Novas aplicações de imagem também pode incluir 2-D ou 3-D de séries temporais usando microscopia de dois fótons. Por exemplo, utilizando-se em bolus de indicadores de cálcio para estudar a actividade neuronal do tronco cerebral e populações de células da glia. Como mostrado na Figura 8, uma solução corante injectados na circulação de sangue através da artéria carótida interna pode ser utilizada para gerar imagens de alto contraste da vasculatura cerebral. Como o corante de fluorescência enche o lúmen dos microvasos e espalha-se para dentro do tecido circundante, pode ser usado não só para o cálculo da permeabilidade soluto aparente da barreira hemato-encefálica, mas também o coeficiente de difusão de solutoficiente no tecido cerebral 3. Uma das principais razões para injetar os solutos fluorescente etiquetado através da artéria carótida é que a solução corante pode ir diretamente para os microvasos no cérebro sem ir ao coração pela primeira vez como em uma injeção na veia da cauda. Isto leva, pelo menos, duas vantagens. Uma delas é que a concentração do corante fluorescente no lúmen dos microvasos pode ser praticamente constante, se a taxa de perfusão é fixado no local da punção. Isto garante a determinação precisa da permeabilidade da barreira sangue-cérebro. Outra é que, se um agente de teste é incluído no perfusato, que vai directamente para passar a barreira sangue-cérebro, sem ser diluída ou combinado com outros factores da circulação do corpo.
Novos experimentos poderão usufruir de animais transgênicos com repórteres fluorescentes geneticamente codificados. Isto proporciona a vantagem de que as sondas fluorescentes não devem ser carregado in situ (a menos que a concepção da experiênciaafirma o contrário), economizando tempo e possivelmente permitindo mais preparações intactas (por exemplo, janelas craniano 17).
Finalmente, as experiências podem ser feitas em outras regiões do tronco cerebral, tais como o azeite ou inferior do núcleo motor facial. O conhecimento sobre neuroanatomia e desenvolvimento de populações celulares específicas em uma dada espécie será importante nesse sentido, particularmente como marcos anatômicos podem mudar à medida que os animais crescem (Figura 1). Esperamos que este protocolo incentiva os outros a estudar estruturas do tronco cerebral ventral utilizando em eletrofisiológico vivo e métodos de imagem.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela concessão G12-RR003060 do NIH / NCRR / RCMI, conceder SC1HD068129 do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano, National Science Foundation CBET 0.754.158 e PSC-CUNY 62337-00 40 da Universidade da Cidade de Nova Eunice Shriver Iorque.
Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |