新生児げっ歯類の腹スカルに開頭術を行うには方法

神経トレーサーのエレクトロポレーション台形体（MNTB）の内側核は、このプロトコルを使用して、以前に検討されている上オリーブ複合体中のセルのグループである。例えば、パッチクランプピペットは、神経トレーサー（ 図6）9 を電気穿孔するために使用することができる。 図6aに示すように、ピペットは、正中線の近くに配置されている場合、結果はdecussating求心性軸索が標識されることである。高開口数水浸対物レンズを装備した二光子顕微鏡は、非常に微細な側副枝（ 図6bの矢印）を含むMNTBに到達画像繊維に使用することができる。 図6cに示されるように、神経トレーサーはまた、直接MNTBに送達することができる。結果は、下側開口数水浸対物レンズ（ 図6d）により撮像して理解できるように、MNTB細胞および求心性軸索の標識である。 M低倍率の対物レンズを用いてのアインの利点は、より広い視野を検査することができることであり、これは、より低い客観的な開口数に空間分解能の低下をもたらすものの、個々のMNTB細胞がウェル（ 図6dの矢印）を識別することができる。年齢P1〜P5のため、これらの実験の平均期間は3.1±1.4時間（N = 22匹）である。 電気生理学の録音自発的なバースト発火は11,13難聴の発症前に、単一MNTB細胞で観察発達電気的活動の一形態である。この外科用プロトコルを使用すると、それはMNTB（図7a-b）のに多極アレイ（polytrodes）を標的とすることも可能である。結果はMNTB細胞のアンサンブルの自発活動の記録である。 図7eは 、P6ラットからの代表的なpolytrode記録を示しています。この実験では、polytrodeを用いて親油性色素DiIで被覆した細い絵筆（ステップ4.1を参照）。記録を行った後に脳を組織学的分析のために処理したDiI標識polytrodeトラックの位置がMNTB（ 図7d）に適切なターゲティングを確認した。年齢P1〜P6のための実験の平均期間は2.0±0.7時間（N = 33匹）である。 微小血管透過性を測定するこのプロトコルはまた、血管透過性の2光子イメージング実験を行うために使用することができる。蛍光溶質（TRITC-デキストラン、MW 155 kDの、ストークス半径〜8.5 nm）の1％BSAリンゲル液に溶解し、頸動脈14内に挿入されたカニューレを介して脳循環に注入した。尾静脈注射とは異なり、この手順では、心をバイパスし、直接脳の微小循環への蛍光溶質を導入しています。図8aは、この手順を使用することから生じる血管系の標識の品質を示す。連続した後図8bに示すように、血流中への標識された溶質の灌流は、それは、関心領域の経時的配列を得ることができる。関心領域内の総蛍光強度をオフラインで測定され、数学的モデルは、蛍光（ 図8c）15溶質を標識するために、血液脳関門透過性を決定するために使用された。年齢のP9-P10のための実験の平均期間は2.3±0.8時間（N = 3匹）である。 図1。新生児ラットにおける血管系のランドマークに関して腹側脳幹神経構造の相対的な位置。脳の側面図。B、脳の腹側を見る。主要な血管は、目的の赤色及び神経構造に示されているインドールであるカラー四角でicated。スケールで描かれていない。 AICA =前下小脳動脈; BAS =脳底動脈; ICV =下大脳静脈; MCA =中大脳動脈; VERT =椎骨動脈; VSP =腹側脊髄動脈。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 図2。手術のセットアップ。、手術は（1）安定したテーブルトップの上に載っ小さなブレッドボード上で行うことができます。加熱パッド（2）及び小動物人工呼吸器（3）必要なときに全体の製造を容易にするために移動させるブレッドボードに固定することができる。小動物人工呼吸器がバッテリーで駆動することができます（4）。マグネットホルダー（5）麻酔薬を送達するために使用ノーズコーンを固定するために使用することができる。ノーズコーン缶また、安定した位置にヘッドを固定するのに役立ちます。動物を再配置する必要がない場合、マイクロマニピュレーター（6）電気生理学または神経トレーシング実験に位置​​プローブに使用することができる。光源（7）及びステレオスコープ（図示せず）は、顕微手術中にランドマークの構造を可視化するために必要である。B、小さなはさみは、ステップ1.4において使用される。cの鉗子は、ステップ1.4、1.6.1、1.8および1.8.1で使用されているするd、スプリングのはさみはステップ1.5、1.6および1.7（e）に使用される、解剖刀、ステップ3.1.2で使用される。 E = 1ミリメートル中のスケールバーは、BDに適用されます。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 図3。挿管のための気管を露出させる。動物は、麻酔をしやすい位置に配置し、ノーズコーンとテープ（破線）で固定されています。B、皮膚が根底にある脂肪層が露出するようにカットし、脇に置かれている。C、その上の脂肪と腺（図示グレー）、気管を露出するように脇にプッシュされます。テープが覆っている皮膚（破線）を固定するために使用される。D、気管が筋肉組織から解剖されており、E、気管リングの可視化は、その上、筋肉の正常な削除を示しています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 図4。動物に挿管する。、二つの縫合糸（白矢印）が気管の周りに結び付けられている（t）をB、挿管チューブ（it）がしっかりと動物ベンチレータするcのy管に接続する必要があり、気管切開は、2つの縫合糸（黒矢印）。dは、換気チューブが挿入される間に行われる2の縫合糸が締められている。スレッドの端部は、E。（白と黒の矢印で示される）交差方式で再び締め付けられて縫合糸終末が接続されています。F、縫合糸終末をトリミングし、挿管が完了している。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 図5。気管の取り外しと開頭を作る。、準備がエラストマーで安定化されている（エリアINSIデ緑破線） ます＃b、気管が識別され、次いでカットが離れて挿管チューブから気管を分離すること、次いで下顎筋（点線）に切断するために最初に製造されている。cの平滑用いて頭蓋骨の表面を清掃技術の筋肉を除去し、脂肪と血。Dを削除するために吸収紙を使用するには、クリーンな領域の例は、最後の脊椎（V）とバシ-後頭骨（BO）を示している。 2つの骨（黒矢印）の間に自然なギャップがある。E、反転次元形状（黒矢印）でのマイクロドリルや超音波洗剤の薄い頭蓋骨を使用する。そっと薄くなった頭蓋骨を破壊した骨の一部を除去します。ランドマーク血管系が表示されるはずです。 女露出脳幹表面の血管ランドマークの高倍率ビュー。 BAS =脳底動脈; AICA =前下小脳動脈。 B = 1ミリメートル中のスケールバーは、CE。highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 図6の神経トレーサーのエレクトロポレーション、神経トレーサーマイクロルビーを含むガラス電極は、正中線（赤い円）の近傍に配置した。トレーサーは7秒の長さ-5μAパルスを用いて電気穿孔した15分間ごとに14秒を達成しました。回復時間の1時間後、ボックス領域は、二光子顕微鏡で画像化した。 P1のラットの子犬。B、MNTBにおける求心性軸索ラベルの模範zスタック画像。矢印は、個々の担保の枝を指す。C、マイクロルビーを充填したガラス電極はMNTB（赤い円）の上に配置した。トレーサーはで説明したのと同じ設定を使用して電気穿孔した。回復時間の1時間後、四角で囲んだ領域があった二光子顕微鏡で画像化した。 P5ラット子犬。D、MNTBにおける標識細胞と軸索の模範zスタック画像。矢印は、単一のMNTB細胞を示している。 b及びcのラベルは、それぞれ、対物レンズの倍率及び開口数を示している。スケールバー、およびC = 300ミクロン; =45μmのB中のスケールバー; D =90μmの中のスケールバー。 AICA =前下小脳動脈; BAS =脳底動脈; Rは吻側; L =横。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 図7。polytrode記録を対象とした、Polytrode、シャンクあたり4電極（黒丸）との4シャンクで構成されています。電極間のイントラとインターシャンクの距離が示されている。B、 </stroNG>電気生理学実験の模範画像。参照電極は、頬空洞内に挿入され、ploytrodeはヘッドステージに接続されている。 P6ラット子犬。C、polytrode標的とするために使用される血管系のランドマークの高倍率ビュー。 polytrodeは（polytrodeトラックは赤で表示されます）台形ボディ（赤箱）。D、ポストホック組織学的分析は、DiIでコーティングされたpolytrodeの正しい標的化を実証するの内側核をターゲットに吻側横座標を使用して配置されている。 電子、模範マルチ·単位記録。トレース順序は、パネルaの電極の順序と同じである。シャンクの録音の中に同じ色を持っている。 E中のスケールバーは5秒間。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 <img alt="図8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig8highres.jpg"幅= "600" /> 脳の微小血管の図8 のin vivo二光子イメージング。頸動脈へのTRITC-デキストラン155 kDの灌流後の脳血管系のA、2-D画像（折りたたまZ-スタック）。結像領域は、 図7cに示したものと同様である。 20x/0.5水浸対物レンズ。 P10ラット子犬ます＃b、関心領域（ROI）は、蛍光強度（赤枠囲った領域）を測定するために使用した。微小血管は、〜14.2ミクロンの直径を有し、182ミクロン脳幹面の下に位置していた。時間の関数としての蛍光強度（正規化値）のcの典型的な曲線。 fluoresenceソリューションだけで血管内腔を埋めたとき、私0は、ROI内の蛍光強度の段階的増加である。 （のdI / dt）は0およびI 0は溶質に微小血管透過性を決定するために使用される。 TRITC-デキストラン155 kDの透過性は、1.5×10 -7 cm /秒であると計算された。B =100μmの中のスケールバーは、に適用されます。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。