Eine Methode, um eine Kraniotomie auf der Bauch Schädel des Neugeborenen Nagetiere Stellen
Summary
Ein chirurgisches Verfahren beschrieben, um die Schädel im ventralen Neugeborene Ratten aus. Mit diesem Ansatz ist es möglich, eine Kraniotomie, um akute Elektrophysiologie und der Zwei-Photonen-Mikroskopie Experimente im Hirnstamm von betäubten Jungtiere durchführen zu öffnen.
Abstract
Die Verwendung einer Kraniotomie in vivo Experimenten bietet die Möglichkeit, die Dynamik diverse zelluläre Prozesse im Gehirn von Säugetieren im Erwachsenenalter und während der Entwicklung zu untersuchen. Obwohl die meisten in-vivo-Ansätze mit einem Schädelhirnregionen, um auf der Rückenseite befindet studieren, Hirnstamm Regionen wie die Brücke, auf der Bauchseite liegt noch relativ wenig erforschten. Das Ziel des Protokolls ist es, den Zugang zu ventralen Hirnstammstrukturen zu erleichtern, so dass sie in vivo unter Verwendung von elektrophysiologischen und bildgebenden Verfahren untersucht werden. Dieser Ansatz ermöglicht Untersuchung der strukturellen Veränderungen im Langstrecken-Axone, Muster der elektrischen Aktivität in Einzel-und Ensembles der Zellen und Veränderungen in der Blut-Hirn-Schranke in Neugeborene Tiere. Obwohl dieses Protokoll wurde vor allem verwendet, um den Hirnstamm in Neugeborene Ratten untersucht werden, kann es leicht für Studien in anderen Nagetieren wie Mäusen Neugeborenen, Erwachsenen-roden angepasst werdents und anderen Hirnstammregionen.
Introduction
Die Verwendung einer Kraniotomie in Kombination mit Fluoreszenz-Bildgebung und Elektro Techniken erlaubt die Überwachung der Blutfluss, Blut-Hirn-Schranken-Durchlässigkeit und die Messung der Aktivität von Neuronen und Gliazellen in lebenden Tieren 1-3. Mehrere Labors haben diesen Ansatz verwendet werden, um Einblick in die Physiologie des Gehirns bei gesunden und Krankheitsbedingungen zu schaffen, aber Lücken in unserem Verständnis, wie diese Prozesse während der Entwicklung entstehen, bleiben. Außerdem haben die meisten Studien zur Hirnregionen, die leicht von der dorsalen Oberfläche des Schädels zugänglich, so dass ventralen Hirnstammstrukturen mit unterschiedlichen physiologischen Rollen wurden hauptsächlich unter Verwendung von Ex-vivo-Ansätze untersucht konzentriert.
Das Ziel des Protokolls ist es, ein Verfahren zum Öffnen einer Kraniotomie an der ventralen Schädel von Nagetieren bereitzustellen. Dieser Ansatz wurde von der klassischen Studien in größeren Säugetieren wie Hunden und Katzen für die sensorische Neurophysiologie durchgeführt reco angepasstrdings des auditorischen Hirnstamm 4-7. In diesem Protokoll besteht jedoch die neuartige Herausforderung, den Vorgang in Neugeborenen Tiere. Mit Gefäß Sehenswürdigkeiten hat dieses Protokoll angepasst vorher benutzt worden, um den auditorischen Hirnstamm der Neugeborene Ratten, Mäusen und anderen erwachsenen Hirnstamm Regionen wie dem unteren Olive 8-11 (Abbildung 1) zu studieren.
Ein Hauptvorteil einer ventralen Kraniotomie gegenüber bestehenden Methoden zur ventralen Hirnstammkerne zu studieren ist, dass es einen direkten Zugang zu den Strukturen von Interesse in lebenden Tieren. Zum Beispiel werden die Zellen des Gehör oberen Olivenkomplex lokalisiert ein paar Dutzend Mikrometer von der Hirnoberfläche, was für die gezielte Platzierung von Sonden und zur Verwendung von Zwei-Photon-Imaging-Ansätze, bei denen Bildtiefe auf 0,5 mm begrenzt ist, Licht Gewebestreuung und Absorption. Ein Bauch Kraniotomie stellt auch eine Zubereitung mit relativ intakten neuronalen Verbindungen, whICH werden bei akuten und organotypischen Präparate 12 gestört. Im Gegensatz zu anderen Protokollen für die Neurophysiologie in vivo Experimente 13 kann ein ventral mit Multielektrodenaufnahme und bildgebende Verfahren, die Informationen über Mobil Ensembles bereitzustellen kombiniert werden (Fig. 6 und 7). Schließlich ist in Verbindung mit diesem Protokoll ein fluoreszierend markierter gelösten Stoffes in das Gefäßsystem injiziert werden, um Veränderungen in Blut-Hirn-Schrankendurchlässigkeit für den gelösten Stoff (8) zu messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Zeit ist entscheidend. Ein erfahrener Forscher sollten in der Lage, dieses Protokoll in 1 Stunde abgeschlossen werden (Schritte 1-3). Die für die verschiedenen Schritte erklärt mal davon eine mittlere bis hohe Kompetenz. Die richtige und rechtzeitige Intubation und Tracheotomie sind kritisch, da schlechte Belüftung Kontrolle kann zu Erstickung und Tod des Tieres führen. Sorgfältige Clearance von Muskel-und Fettgewebe ist auch sehr wichtig, denn Fehler können zu unkontrollierten Blutungen und zum Tod des Tieres führen. Ebenso, wenn die Vorbereitung der Halsschlagader für die Kanüle Insertion, muss man vorsichtig anziehen und schneiden die Arterie, wenn der Thread Knoten wird locker unkontrollierte Blutungen stattfinden wird. Schließlich sollte die Kraniotomie sorgfältig gemacht werden, ohne die Gefäß Sehenswürdigkeiten stören. Careless Entfernung der externen Hirnhautschicht (Dura) kann zu schweren Blutungen und Schäden an der arterielle Versorgung führen.
Beatmungseinstellungen sind nach dem Alter des Tieres gewählt.Die meisten kommerziellen Anbieter nützliche Informationen über solche Einstellungen. Experimente an Ratten, die älter als P15 wird die Verwendung einer großen Tierbeatmungsgerät benötigen. Erwachsene Tiere können nicht Belüftung benötigen, wenn mit Ketamin / Xylazin, aber Intubation wird empfohlen, die Flüssigkeit in die Luftröhre zu vermeiden.
Eine Hauptbeschränkung dieses Protokolls ist, dass Experimente nur akut durchgeführt werden. In unserem Labor haben wir Experimente mit einer Dauer von zwei bis zehn Stunden durchgeführt. Eine zweite Einschränkung ist, dass Experimente wurden unter Vollnarkose durchgeführt werden. Daher ist die Wahl der Betäubung eine wichtige Variable bei der Planung und Gestaltung der Experimente zu betrachten. Ein ähnliches Problem ist, dass Neugeborene Tiere können besonders empfindlich auf eine Überdosierung sein. Zum Beispiel, wenn die Wahl Ketamin / Xylazin-Mix, die Berechnung der Dosis bezogen auf das Gewicht der Welpen und zu verwalten, Medikamente zu ⅓ der maximalen Lautstärke. Überprüfen Sie den Zustand des Tieres alle 5-10 Minuten mit dem Fuß Prise response. Bei Verwendung von Isofluran, sind Vorsichtsmaßnahmen auch notwendig, um eine sichere Umgebung für die Ermittler (richtige Belüftung und eine richtig kalibriert Verdampfer) zu halten.
Das Stereomikroskop kann auf einem flexiblen Halter Betrachtungswinkel einzustellen und Lückenzwischenraum zu erleichtern, um die Elektroden und die Verlagerung des Tieres auf das Zwei-Photonen-Mikroskop Stelle montiert werden. Die Verwendung eines Akkus, um den Ventilator einschalten können, erleichtern das Tier bewegt und elektrische Artefakte während der elektrophysiologischen Experimente zu reduzieren. Zu diesem Zweck kann ein kleines Steckbrett (7,5 x 12 Zoll) verwendet, die zusammen Ventilator, Heizkissen und der narkotisierten Tier (Abbildung 2a) zu montieren werden. Eine nützliche und wichtige Änderungen an dieser Konfiguration ist die Zugabe einer Vorrichtung zur Überwachung der Vitalfunktionen während der Operation. Ein Oxymeter oder anderen analogen Geräten in Abhängigkeit von der Labor Haushalt verwendet werden.
Dieses Protokoll wurde mit Elektrophysiologie und Bildgebung erfüllt eingesetztTragmulden, einschließlich Patch-Clamp-Aufnahmen 8,10,11, polytrode Aufnahmen (Figur 7), und der Zwei-Photonen-Bildgebung 9 (Fig. 6 und 8). Eine mögliche zukünftige Anwendung wäre es, diese Methoden für die Ausrichtung fluoreszenzmarkierten Zellen für elektrophysiologische Aufnahme 16 zu kombinieren.
Neue Imaging-Anwendungen kann auch 2-D oder 3-D-Zeitreihe mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Beispielsweise unter Verwendung von Calcium-Bolus Ladeindikatoren, die Aktivität des Hirnstamms neuronalen und glialen Zellpopulationen zu untersuchen. Wie in Fig. 8 gezeigt ist, eingespritzt wird eine Farbstofflösung in den Blutkreislauf durch die Halsschlagader verwendet werden, um Bilder mit hohem Kontrast von Hirngefäßsystem zu erzeugen. Da der Fluoreszenzfarbstoff füllt die Mikrogefäßlumen und breitet sich in das umgebende Gewebe, kann es nicht nur zur Berechnung der scheinbaren gelösten Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke, sondern auch die Diffusion gelöster Stoff verwendet werden COEFreichend in das Hirngewebe 3. Ein Hauptgrund für die Injektion der fluoreszenzmarkierten gelösten Stoffen über die Halsschlagader ist, dass die Farbstofflösung kann direkt zu den Mikrogefäßen im Gehirn zu gehen, ohne zuerst auf das Herz in einer Injektion in die Schwanzvene. Das bringt zumindest zwei Vorteile. Einer ist, dass die Fluoreszenzfarbstoffkonzentration in der Mikrogefäßlumen kann praktisch konstant sein, wenn die Durchblutungsrate in der Kanülierungsstelle befestigt. Dies gewährleistet eine genaue Bestimmung der Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität. Ein weiterer Grund ist, dass, wenn ein Testmittel im Perfusat enthalten ist, wird es direkt an der Blut-Hirn-Schranke zu gehen, ohne verdünnt oder mit anderen Faktoren von dem Körperkreislauf in Verbindung.
Neue Experimente können auch Vorteil von transgenen Tieren, die mit genetisch kodierten Fluoreszenz Reportern zu nehmen. Dies hätte den Vorteil, dass fluoreszierende Sonden müssten nicht in situ geladen werden kann (es sei denn, das Design des Experimentsbesagt nichts anderes), das spart Zeit und vielleicht so für mehr intakt Zubereitungen (z. B. Hirn Fenster 17).
Schließlich können Experimente in anderen Hirnstammregionen wie die unteren Olive oder Nucleus facialis erfolgen. Das Wissen über die Neuroanatomie und die Entwicklung von spezifischen Zellpopulationen in einer bestimmten Art werden zu diesem Zweck von Bedeutung sein, insbesondere da anatomische Landmarken kann sich ändern, wie die Tiere wachsen (Abbildung 1). Wir hoffen, dass dieses Protokoll ermutigt andere, ventralen Hirnstammstrukturen in vivo Studie mit elektrophysiologischen und bildgebenden Verfahren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Gewährung G12-RR003060 von NIH / NCRR / RCMI unterstützt wird, gewähren SC1HD068129 vom Eunice Shriver National Institute of Child Health & Human Development, National Science Foundation CBET 0754158 und PSC-CUNY 62337-00 40 von der City University of New York.
Materials
| Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
| Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
| Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
| Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
| DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
| Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
| Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
| Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
| Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
| Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
| Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
| Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
| Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
| Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
| Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
| Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
| Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |
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