שיטה כירורגית מתוארת לחשוף את גולגולת הגחון בחולדות ילוד. שימוש בגישה זו ניתן לפתוח craniotomy לבצע אלקטרופיזיולוגיה חריפה וניסויים במיקרוסקופ שני פוטונים בגזע המוח של גורים מורדמים.
השימוש בפתיחת גולגולת לin vivo ניסויים מספקת הזדמנות לחקור את הדינמיקה של תהליכים תאיים שונים במוח של היונקים בבגרות ובפיתוח. למרות שרוב in vivo גישות להשתמש craniotomy ללמוד אזורים במוח הממוקמים בצד הגב, אזורי גזע המוח כגון גשר המוח, הממוקם בצד הגחון יישארו יחסית understudied. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא כדי להקל על גישה למבני גזע המוח הגחון, כך שהם יכולים להיות למדו בvivo באמצעות אלקטרו ושיטות הדמיה. גישה זו מאפשרת למחקר של שינויים מבניים באקסונים ארוך טווח, דפוסים של פעילות חשמלית באחת והרכבים של תאים, ושינויים בחדירות מחסום דם מוח בבעלי חיים ילוד. למרות שפרוטוקול זה נעשה שימוש בעיקר כדי ללמוד את גזע המוח השמיעתי אצל חולדות ילודות, זה יכול בקלות להיות מותאם ללימודים במינים מכרסמים אחרים כגון עכברים ילודים, רודן מבוגרts ואזורי גזע המוח אחרים.
השימוש בפתיחת גולגולת בשילוב עם דימות פלואורסצנטי וטכניקות אלקטרופיזיולוגיה מאפשרת זרימת דם ניטור, חדירות מחסום דם המוח ומדידת פעילותם של תאי עצב ותאי גליה בבעלי החיים 1-3. מספר מעבדות השתמשו בגישה זו כדי לספק תובנות לגבי הפיסיולוגיה של מוח בתנאים בריאים ומחלה, אך נותרו פערים בהבנה של איך תהליכים אלה להתעורר במהלך פיתוח שלנו. יתר על כן, רוב המחקרים התמקדו באזורים במוח שהם נגישים מהשטח הגבי של הגולגולת, כך שמבני גזע המוח הגחון עם תפקידים פיסיולוגיים מגוונים נחקרו בעיקר באמצעות vivo לשעבר גישות.
המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לספק שיטה לפתיחת craniotomy בגולגולת הגחון של מכרסמים. גישה זו הותאמה ממחקרים קלאסיים שבוצעו ביונקים גדולים יותר כגון כלבים וחתולים לreco נוירופיזיולוגיה חושיrdings של גזע המוח השמיעתי 4-7. בפרוטוקול זה לעומת זאת, יש את אתגר הרומן של ביצוע ההליך בבעלי חיים ילוד. באמצעות ציוני דרך בכלי דם, פרוטוקול מותאם זה כבר נעשה שימוש בעבר כדי ללמוד גזע המוח השמיעתי של חולדות ילודות, עכברים בוגרים ואזורי גזע המוח אחרים כמו הזית הנחותה 8-11 (איור 1).
יתרון עיקרי של פתיחת גולגולת הגחון על פני שיטות קיימות ללמוד גרעיני גזע המוח הגחון הוא שהיא מספקת גישה ישירה למבני עניין בחי חיות. לדוגמא, התאים הקוליים של מתחם olivary מעולה הם נקודתיים כמה עשרות מיקרומטרים ממשטח המוח, וזה חשוב עבור מיקום ממוקד של בדיקות ולשימוש בגישות הדמיה שני פוטונים שבעומק ההדמיה יכול להיות מוגבלת ל0.5 מ"מ על ידי פיזור אור רקמות וקליטה. פתיחת גולגולת הגחון מספקת גם הכנה עם קשרים עצביים יחסית ללא פגע, WHich הם שיבשו בהכנות פרוסה חריפות וorganotypic 12. בניגוד לפרוטוקולים אחרים לניסויי in vivo נוירופיזיולוגיה 13, גישת הגחון יכולה להיות משולבת במכשירי הקלטה רבת האלקטרודה ושיטות הדמיה המספקות מידע על הרכבים סלולריים (איורים 6 ו -7). לבסוף, בשילוב עם פרוטוקול זה מומס שכותרתו fluorescently ניתן להזריק בכלי הדם כדי למדוד שינויים בחדירות מחסום דם מוח למומס (איור 8).
זמן הוא קריטי. חוקר מנוסה צריך להיות מסוגל להשלים את הפרוטוקול זה בשעה 1 (שלבים 1-3). הפעמים נאמרו לצעדים השונים מניחות בינוניות לרמה הגבוהה של מומחיות. הנשמה ואינטובציה נכונה בזמן נכון הן קריטיים, שכן שליטת אוורור הלקויה יכולה להוביל לחנק ומוות של בעלי החיים. פינוי זהיר של רקמות שריר ושומן הוא גם מאוד חשוב, כי טעויות יכולות להוביל לדימום ולמוות בלתי מבוקרים של בעלי החיים. בדומה לכך, בעת הכנת העורק הראשי להכנסה canula, צריך להדק ולחתוך את העורק בזהירות, אם קשר החוט הופך רפוי דימום בלתי נשלט יתקיים. לבסוף, פתיחת הגולגולת צריכה להיעשות בזהירות, מבלי לשבש את ציוני הדרך בכלי הדם. ההסרה רשלנית של השכבה החיצונית קרום המוח (דורה) יכולה להוביל לדימום ונזק של אספקת העורקים חמורים.
הגדרות אוורור נבחרות בהתאם לגילו של בעל החיים.רוב הספקים המסחריים מספקים מידע שימושי אודות הגדרות כאלה. ניסויים בחולדות מבוגרות יותר P15 ידרשו שימוש במכונת הנשמה של בעלי חיים גדולה. בעלי חיים מבוגרים ייתכן שלא צריכים אוורור אם מורדם עם קטמין / xylazine, אבל אינטובציה מומלצת להימנע מנוזל שנכנס לקנה הנשימה.
מגבלה העיקרית אחת של פרוטוקול זה היא שניתן לבצע רק ניסויים בחריפות. במעבדה שלנו יש לנו לבצע ניסויים שנמשכו בין שניים לעד עשר שעות. מגבלה שנייה היא שניסויים צריכים להתבצע תחת הרדמה. לכן, הבחירה של חומר הרדמה היא משתנה חשוב להביא בחשבון בתכנון ובעיצוב של ניסויים. סוגיה קרובה היא כי בעלי חיים ילוד יכולים להיות רגישים במיוחד למינון יתר. לדוגמא, אם בוחר קטמין / תמהיל xylazine, לחשב את המינון המבוסס על המשקל של הגור ולנהל תרופות ב⅓ מהנפח המקסימאלי. בדוק את מצבו של בעל החיים בכל 5-10 דקות על ידי r קמצוץ הבוהןesponse. אם באמצעות isoflurane, אמצעי זהירות נחוץ גם כדי לשמור על סביבה בטוחה לחוקר (אוורור נאות, ומאדה מכויל כראוי).
סטראו יכול להיות מותקן על בעל גמיש כדי להתאים את זווית צפייה ולהקל על פינוי מקום למקום אלקטרודות והעברה של בעלי החיים למיקרוסקופ שני פוטונים. שימוש בסוללה לשלטון ההנשמה יכול להקל על העברת בעלי החיים ולצמצם את החפצים חשמליים במהלך ניסויי אלקטרופיזיולוגיה. לשם כך, קרש חיתוך קטן (7.5 x 12 סנטימטר) יכול לשמש כדי להרכיב יחד את מכונת ההנשמה, כרית חימום ו( איור 2 א) חיה הרדים. שינוי שימושי וחשוב להגדרה זו הוא התוספת של מכשיר לניטור סימנים חיוניים במהלך ניתוח. Oxymeter או התקנים אנלוגיים אחרים ניתן להשתמש בהתאם לתקציב המעבדה.
פרוטוקול זה כבר נעשה שימוש באלקטרופיזיולוגיה והדמיה נפגשהמגשי בנאים, כולל הקלטות צמד תיקון 8,10,11, הקלטות polytrode (איור 7), ושני פוטונים הדמיה 9 (איורים 6 ו -8). יישום עתידי אפשרי אחת יהיה לשלב שיטות אלה למיקוד תאים שכותרתו fluorescently להקלטת אלקטרו 16.
יישומי הדמיה חדשים עשויים לכלול גם 2-D או סדרת זמן 3-D באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים. לדוגמא, באמצעות טעינת בולוס של מדדי סידן כדי ללמוד את הפעילות עצבית בגזע המוח ואוכלוסיות תאי גליה. כפי שניתן לראות באיור 8, פתרון צבע מוזרק לתוך מחזור הדם דרך העורק הראשי יכול לשמש כדי ליצור תמונות עם ניגודיות גבוהות של כלי הדם במוח. כצבע פלואורסצנטי ממלא את לומן הדם הקטן ומתפשט לרקמות שמסביב, זה יכול לשמש לא רק לחישוב החדירות מומסות, לכאורה, של מחסום דם המוח, אלא גם COEF דיפוזיה המומסficient ברקמת המוח 3. אחת סיבות עיקריות להזרקת המומסים שכותרתו fluorescently דרך עורק התרדמה היא שהפתרון לצבוע ישירות יכול ללכת לmicrovessels במוח מבלי להיכנס ללב הראשון כמו בהזרקה לוריד זנב. זה מביא לפחות שני יתרונות. אחת הוא שריכוז צבע פלואורסצנטי בלומן הדם הקטן יכול להיות קבוע כמעט, אם קצב טפטוף קבוע באתר cannulation. זה מבטיח קביעה מדויקת של חדירות מחסום דם המוח. נוסף הוא שאם סוכן בדיקה כלול בperfusate, זה יהיה ללכת ישירות למחסום דם המוח מבלי להיות מדולל או בשילוב עם גורמים אחרים ממחזור הגוף.
ניסויים חדשים יכולים גם לקחת את יתרון של בעלי חיים מהונדסים עם כתבי ניאון מקודדים גנטי. זה יספק את היתרון שבדיקות ניאון לא צריכה להיות טעונות באתרו (אלא אם כן את העיצוב של הניסויקובע אחר), תוך חיסכון בזמן ואולי גם מאפשר ליותר הכנות שלמות (לדוגמא חלון גולגולתי 17).
לבסוף, ניתן לעשות ניסויים באזורי גזע המוח אחרים כגון זית הנחות או בגרעין המוטורי פנים. ידע על neuroanatomy ופיתוח של אוכלוסיות תאיות ספציפיות במין נתון יהיה חשוב לקראת מטרה זו, במיוחד כציוני דרך אנטומיים עשויות להשתנות כחיות לגדול (איור 1). אנו מקווים פרוטוקול זה מעודד אחר ללמוד מבני גזע המוח הגחון באמצעות באלקטרו vivo ושיטות הדמיה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק G12-RR003060 מ-NIH / NCRR / RCMI, להעניק SC1HD068129 מהמכון הלאומי יוניס שרייבר של בריאות ופיתוח אנושי לילדים, הקרן הלאומית למדע CBET 0,754,158 וPSC-CUNY 62,337-00 40 מאוניברסיטת העיר ניו יורק.
Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |