In questo lavoro, si descrive una procedura ottimizzata per l'estrazione e l'analisi di prostaglandine e altri eicosanoidi da<em> C. elegans</em> Usando LC-MS/MS.
Caenorhabditis elegans sta emergendo come un modello animale potente per studiare la biologia dei lipidi 1-9. Prostaglandine sono una classe importante di eicosanoidi, che sono segnali lipidici derivati da acidi grassi poliinsaturi (PUFA) 10-14. Queste molecole di segnalazione sono difficili da studiare a causa della loro bassa abbondanza e natura reattiva. La caratteristica di prostaglandine è una struttura ad anello ciclopentano situato all'interno della spina dorsale acido grasso. Nei mammiferi, le prostaglandine possono essere formati attraverso enzima cicloossigenasi-dipendente percorsi e indipendenti 10,15. C. elegans sintetizza una vasta gamma di prostaglandine indipendenti della ciclossigenasi 6,16,17. Una vasta classe di prostaglandine della serie F è stato identificato, ma lo studio di eicosanoidi è in una fase iniziale con ampio spazio per nuove scoperte. Qui si descrive una procedura per estrarre e analizzare prostaglandine e altri eicosanoidi. Lipidico Chargeds sono estratti da colture verme massa utilizzando una tecnica di estrazione liquido-liquido e analizzati mediante cromatografia liquida accoppiata a ionizzazione elettrospray spettrometria di massa tandem (LC-ESI-MS/MS). L'inclusione degli analoghi deuterati di prostaglandine, come PGF 2 α-d 4 come è raccomandato uno standard interno per l'analisi quantitativa. Monitoraggio reazione multipla o MRM può essere utilizzato per quantificare e confrontare i tipi di prostaglandine specifiche tra gli animali wild-type e mutanti. Decomposizione indotta da collisione o MS / MS possono essere utilizzati per ottenere informazioni su importanti caratteristiche strutturali. Cromatografia liquida e spettrometria di massa (LC-MS) scansioni di indagine di una gamma selezionata di massa, come la m / z 315-360 può essere utilizzato per valutare i cambiamenti globali nei livelli di prostaglandine. Forniamo alcuni esempi di tutte e tre le analisi. Questi metodi fornirà ai ricercatori un set di strumenti per la scoperta di nuovi eicosanoidi e delineando le loro vie metaboliche.
Le prostaglandine (PG) sono una classe importante di ormoni lipidici che sono stati ampiamente studiati e implicati nella regolazione riproduzione, immunità, e lo sviluppo in una vasta gamma di organismi 12-14. PG sono ideali per i sistemi globali di analisi di biologia in quanto comprendono una serie di lipidi derivati da un precursore comune (s). Il nematode C. elegans è uno degli organismi modello più utilizzati per affrontare le questioni fondamentali della genetica e della biologia dei sistemi.
Abbiamo dimostrato che C. elegans sintetizza PG della serie F che guida spermatozoi mobili di ovociti 3,6,16. PG serie F derivati da PUFA 20-carbonio a tre, quattro, cinque e doppi legami, comprendente la F1, F2, F3 e classi, rispettivamente, sono stati identificati 3,16. Questi PG sono sintetizzati indipendente di enzimi cicloossigenasi, eppure stereoisomeri PGF 2α 1α e PGF sono ancora generated. Per le analisi qualitative e quantitative di C. elegans PG, LC-MS/MS è un potente e sensibile tecnica analitica. Prima di eseguire questa analisi, è importante sviluppare un metodo di estrazione ottimizzato per le prestazioni del processo analitico dipende fortemente dalla qualità dell'estratto. Cromatografia liquida e spettrometria di massa possono fornire solo la massa anticipato rapporto carica (m / z), così come la forma del picco desiderabile e tempo di ritenzione dello ione genitore PG. Profilo metabolico di PG in C. elegans è un compito impegnativo che richiede diverse strategie di acquisizione di MS.
Scansione o indagine scansione completa LC-MS (Q1 scansione) ha il vantaggio di garantire che la maggior PG ionizzabili genereranno una risposta di spettrometria di massa. Mentre la scansione indagine fornisce utili informazioni sul profilo complessivo di PG rispetto al wild-type e mutante C. elegans, rilevamento di PG minori è compromessa a causa della bassa sensibilità. Neverthemeno, la scansione LC-MS indagine può dare una visione globale di PG ed è particolarmente utile per analizzare i mutanti previsti per influenzare il metabolismo di una vasta popolazione PG.
Nella identificazione metabolita, l'analisi LC-MS/MS di standard PG sintesi chimica viene eseguita prima di ottenere i loro spettri di ioni prodotto come composti di riferimento. Questi spettri può essere paragonato allo spettro di un metabolita sconosciuto. Multimodo reazione di monitoraggio (MRM) è utilizzato per una maggiore sensibilità e specificità. Un esperimento MRM avviene specificando il genitore ioni / ioni prodotto massa transizione di un composto. Conoscendo la massa e la struttura degli analiti bersaglio, è possibile prevedere teorici transizioni MRM per molti metaboliti sconosciuti.
Un metodo LC-MS/MS ottimizzato per la profilatura PG isomeri in C. elegans non è stata riportata. Qui si descrive un approccio integrato di estrazione e di spettrometria di massa consistente di LC-MS e LC-Metodi di MS / MS per la rilevazione, quantificazione, e indagando C. elegans PG metaboliti. Questo approccio può essere applicato ad altri eicosanoidi.
Descriviamo una procedura per l'estrazione degli eicosanoidi e analisi, concentrandosi su PG F-series. Ci sono diverse parti della procedura che può essere problematico. In primo luogo, è fondamentale che le colture a vite senza fine non morire di fame, come la fame può alterare il metabolismo PG. Per l'alimentazione supplementare, NA22 batteri sono raccomandati al posto dei più comunemente usati OP50 batteri perché NA22 raggiunge una maggiore densità. Tuttavia, il ceppo NA22 manca di resistenza agli antibiotici ed è più suscettibile alla contaminazione. In secondo luogo, i vermi sintetizzano i singoli isomeri PG in basso relativa abbondanza di tessuti dei mammiferi. Ciò può essere dovuto in parte alla ridondanza tra i numerosi isomeri. Si consiglia di circa 6 g di tessuto per l'analisi completa e segnali più forti. Meno tessuto (1-2 g) può essere utilizzata se l'estratto secco è risospeso in meno metanolo: soluzione acquosa per aumentare la concentrazione PG. Tuttavia, solo uno o due iniezioni possono essere eseguite. Il limite di rivelazione del nostro sistema LC-MS/MS è circa 10 pgPGF 2α / ml. Un ml di densamente vermi stadio miste (circa 1 g) produce circa 25-50 pg di CePGF2. Sistemi di spettrometria di massa più sensibili possono ridurre la quantità di tessuto senza fine per l'analisi. In terzo luogo, le differenze in termini di efficienza di estrazione PG tra i campioni possono causare risultati variabili. Abbiamo trovato che l'efficienza di estrazione è molto simile quando i tessuti vengono estratti in parallelo. Per determinare l'efficienza, aggiungere 1,0 ng di PGF 2α-d 4 alla fase di omogeneizzazione come controllo interno. MRM utilizzando transizione massa m / z 357/197 viene usato per misurare PGF 2α concentrazione-d4 rispetto ad un 1 ng / ml di soluzione standard. La quantità di PGF 2α-d 4 persi durante l'estrazione viene quindi calcolata.
I parametri cromatografici e transizioni di massa che abbiamo inserito può essere modificato per rilevare altri PG ed eicosanoidi. Nonostante i notevoli sforzi, non siamo stati in grado di identificare serie D o E-serIES PGS negli estratti 17. Inoltre, non abbiamo rilevato 8-iso PGF 2α e 8-iso PGE2 che sono caratteristici del libero perossidazione radicale-iniziato, che genera una miscela non selettivo di PG stereoisomeri 19. Sia i worm sintetizzano altri tipi PG non è noto. Gli endocannabinoidi e vari metaboliti epossidiche e idrossi di arachidonico e acido eicosapentaenoico sono stati trovati in C. elegans estrae 5,7,20,21. Si consiglia l'uso di entrambi MRM e MS / MS rispetto agli standard autentici per la quantificazione e l'identificazione, rispettivamente. Per nuove eicosanoidi, queste analisi dovrebbero essere combinati con uno studio comparativo di mutanti grassi, che sono carenti in PUFA sintetizzare enzimi 22, così come un saggio funzionale, se possibile. Un avvertimento per analizzare i mutanti di grasso è che piccole quantità di acidi grassi polinsaturi presenti nel vermi sono sufficienti per la sintesi di PG. Per esempio, i grassi-2 (wa17) mutantiavere una piccola quantità di D12 dell'attività desaturasi (~ 5% di tipo selvaggio 22) e questi mutanti producono ancora PG 6. grasso-3 (WA22) e grasso-4 (WA14) mutanti non riescono a sintetizzare derivati da PG arachidonico e acidi eicosapentaenoico 16 . Abbiamo anche trovato che i mutanti grasso compensare la perdita di classi PUFA fino regolando-sintesi di PG dalle classi rimanenti. Per esempio, grasso-3 (WA22) mutanti non riescono a sintetizzare maggior PG derivati da PUFA 20-carbonio. Al contrario, essi sembrano up-regolare romanzo PG derivati dal 18-carbonio PUFA 16. Ad oggi, non abbiamo individuato una C. elegans ceppo che è completamente carenti di sintesi di PG. E 'possibile che i PG sono essenziali per la crescita o di sviluppo.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo i Metabolomica UAB mirati e Proteomica laboratorio, che è stato sostenuto in parte dal UAB pelle Disease Research Center (P30 AR050948 a C. Elmets), la UAB-UCSD O'Brien Acute Kidney Injury Center (P30 DK079337 di A. Agarwal ) e la UAB Lung Health Center (R01 HL114439, R01 HL110950 di JE Blalock). Il supporto per lo spettrometro di massa è stato da un NCRR condivisa Instrumentation concessione (S10 RR19261 a S. Barnes). Ringraziamo anche Ray Moore per il supporto tecnico. C. elegans ceppi sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center, che è finanziato dal NIH. Questo lavoro è stato supportato dal NIH (R01GM085105 a MAM, compreso un supplemento amministrativo ARRA).
REAGENTS | |||||||||||||||||
X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
EQUIPMENT | |||||||||||||||||
CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
|