在本文中,我们描述了一个优化的过程,前列腺素等类花生酸类物质的提取和分析<em> C。线虫</em利用LC-MS/MS。
线虫正在成为一个强大的动物模型来研究生物学脂质1-9。前列腺素是一类重要的类二十烷酸,是脂质信号是来自于多不饱和脂肪酸(PUFAs)10-14。这些信号分子是很难研究,因为他们的低丰度和反应性。前列腺素的特征是环戊烷环结构的位于脂肪酸骨干内。在哺乳动物中,前列腺素可以通过环加氧酶的酶-依赖性和非依赖性通路10,15形成。C.线虫独立环氧合酶6,16,17广泛的前列腺素合成。一个大F系列前列腺素类已经确定,但花生酸类物质的研究是在早期阶段有足够的空间,新的发现。在这里,我们描述了一个过程,前列腺素和其他类花生酸类物质的提取和分析。带电脂质s的提取从大量的蠕虫病毒培养,采用液 – 液萃取技术,液相色谱 – 电喷雾电离串联质谱(LC-ESI-MS/MS)分析。氘化的前列腺素类似物,如前列腺素F 2α-d 4中的夹杂物,作为内标,建议进行定量分析。可以使用多反应监测或MRM量化和比较野生型和突变型的动物之间的特定类型的前列腺素。碰撞诱导分解或MS / MS可以使用以获得有关的重要结构特征。液相色谱-质谱(LC-MS)调查选定的质量范围的扫描,如M / Z 315-360可以用来评估全球变化中的前列腺素水平。我们提供所有三个分析的例子。这些方法将为研究人员提供一个工具集,用于发现新的花生四烯酸,其代谢途径及划定。
前列腺素(PGs的)是一类重要的脂质激素已被广泛地研究,并在调节再生,免疫和发展在广泛的生物体12-14牵连。全面的系统生物学分析的PG非常适合,因为它们包含了一系列来自一个共同的前体(S)的血脂。线虫C.线虫遗传学和系统生物学来解决根本问题,是使用最广泛的模式生物之一。
我们已经证明,C。线虫综合F系列的PG,活动精子卵母细胞3,6,16指南。已经确定,三个,四个,五个双键组成的F1,F2,和F3类,分别从20个碳的多不饱和脂肪酸衍生的前列腺素F系列3,16。这些前列腺素合成独立环氧合酶尚未PGF1α和PGF2α立体的的,仍然GEnerated。 C.进行定性和定量分析线虫 PGS,LC-MS/MS是一个强大和敏感的分析技术。在执行这一分析之前,重要的是开发优化的提取方法,因为在分析过程的性能很大程度上依赖于提取物的质量。液相色谱法和质谱法只能提供预期的质荷比(M / Z),以及理想的峰形和保留时间为PG母离子。 C.前列腺素的代谢谱线虫是一项艰巨的任务,需要各种不同的MS收购策略。
LC-MS全扫描或调查扫描(Q1的扫描)确保,最电离的PG的生成质谱反应的优点。虽然调查扫描相对于野生型和突变型C.前列腺素的总分析提供有用的信息线虫 ,因轻微的前列腺素的检测灵敏度低。然而以下,液相色谱 – 质谱联用仪测量扫描可以给的全局视图的PG,用于分析预测影响代谢的一个大的PG人口的突变体是特别有用的。
在代谢物鉴定,LC-MS/MS分析化学合成PG标准是第一次演出,以取得他们的产品作为参考化合物离子光谱。这些光谱进行比较的一个未知的代谢物谱。多反应监测(MRM)模式用于增强的敏感性和特异性。 MRM实验中是通过指定母离子/产物离子质量的化合物过渡。通过了解的质量和目标分析物的结构,它是可以预测理论的MRM离子在很多未知的代谢物。
一个优化的LC-MS/MS方法分析异构前列腺素C.线虫尚未见报道。在这里,我们描述了一个提取和综合质谱法组成的LC-MS和LC-MS / MS方法进行检测,量化,并调查C.线虫 PG代谢产物。这种方法可以应用到其他的类二十烷酸。
我们描述了一个程序类花生酸的提取和分析,重点对F系列的PG。有几个部分的程序,可能会产生问题。首先,重要的是该蠕虫的文化不挨饿,饥饿可以改变PG代谢。对于补充喂养,NA22细菌的建议,而不是更常用的OP50细菌,因为NA22达到更高的密度。然而,NA22菌株缺乏抗生素的耐药性,更容易受到污染。其次,蠕虫个人PG异构体合成,低丰度相对哺乳动物组织。这可能是部分原因是由于众多的异构体之间的冗余。我们建议约6克组织进行全面的分析和更强的信号。可以使用,如果较少的组织(1-2克)的干燥的萃取物再悬浮在更短的甲醇:水的溶液,以增加PG浓度。但是,只有一到两个注射剂可以被执行。我们的LC-MS/MS系统的检出限约10皮克PGF2α/毫升。密密麻麻的混合阶段蠕虫毫升(约1克)产生大约25-50皮克CePGF2。更敏感的质谱系统,可以减少分析所需的蜗杆组织的量。第三,样品PG提取效率之间的差异可以导致不同的结果。我们已经发现,提取效率是非常类似的,当组织中提取平行。要确定效率,加1.0纳克的PGF2α-D 4日作为内部控制的同质化步骤。 MRM 的m / z 357/197用于测量前列腺素F2α-d4上的浓度,相对于1 ng / ml的标准溶液,使用大量过渡。在提取过程中丢失的PGF2α-d 4中的量,然后计算。
可以改变的色谱参数和质量转变,我们包括检测其他的前列腺素和花生四烯酸。尽管有相当大的努力,我们一直无法识别D系列或E-SERIES PGS提取物中17。此外,我们并没有发现8 -异前列腺素F2α,8 -异PGE 2的自由基引发的过氧化反应,生成PG的立体异构体19是一种非选择性的混合物的特征。不知道是否蠕虫其他类型的PG合成。在C中已发现的内源性大麻素和各种环氧基和羟基代谢产物花生四烯酸和二十碳五酸线虫提取5,7,20,21。我们建议使用MRM和MS / MS相比正宗的定性和定量的标准,分别。小说类花生酸类物质,这些分析应结合脂肪的突变体,这是缺乏多不饱和脂肪酸合成酶22,以及一个功能检测,如果可能的话进行比较研究。分钟蠕虫中存在的多不饱和脂肪酸的数量是足够的PG合成分析脂肪的突变体是一个警告。例如, 脂肪-2(WA17)突变体的D12去饱和酶的活性有少量(野生型的22%〜5%),这些突变体仍能产生前列腺素6。 脂肪3(WA22)和脂肪-4(WA14),突变体不能合成的PG是来自于花生四烯酸和二十碳五酸16 。我们还发现, 脂肪的突变体通过上调PG合成的多不饱和脂肪酸类的损失,其余类补偿。例如,的脂肪-3(WA22)突变体没有大多数来自20个碳的多不饱和脂肪酸的PG的合成。相反,他们似乎上调小说PGS来自18碳不饱和脂肪酸16。到今天为止,我们还没有确定C.线虫应变PG的合成,是完全缺乏。这是可能的,前列腺素是必不可少的生长或发展。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢UAB的有针对性的代谢组学和蛋白质组学实验室,已支持部分由UAB的皮肤疾病研究中心(P30 AR050948 C. Elmets),UAB的加州大学圣地亚哥分校奥布莱恩急性肾损伤中心(P30 DK079337 A.阿加瓦尔)和UAB的肺部健康中心(R01,R01 HL110950 HL114439乙脑布莱洛克)。支持用于质谱仪是从一个,NCRR共享仪表授予(S10 RR19261 S.巴恩斯)。我们也感谢雷·摩尔的技术支持。C.线虫线虫遗传学中心,这是由NIH资助的菌株。这项工作得到由NIH(R01GM085105 MAM,包括ARRA行政补充)。
REAGENTS | |||||||||||||||||
X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
EQUIPMENT | |||||||||||||||||
CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
|