본 논문에서, 우리는 프로스타글란딘 및 기타 에이코 사 노이드의 추출 및 분석을위한 최적의 절차를 설명<em> C. 엘레</em> LC-MS/MS를 사용하여.
Caenorhabditis의 엘레은 지질 1-9의 생물학을 공부하는 강력한 동물 모델로 떠오르고있다. 프로스타글란딘은 고도 불포화 지방산 (된 PUFA) 10-14에서 파생 된 지질 신호입니다 에이코 사 노이드의 중요한 클래스이다. 이 신호 분자 때문에 그들의 낮은 풍부하고 반응 특성을 연구하기가 어렵습니다. 프로스타글란딘의 특성 기능은 지방산 백본에 위치한 시클로 고리 구조입니다. 포유류, 프로스타글란딘은 cyclooxygenase 효소에 의존하고 독립적 인 경로 10,15을 통해 형성 될 수있다. C.는 엘레은 cyclooxygenases 6,16,17 독립적 인 프로스타글란딘의 다양한 배열을 합성. F-시리즈 프로스타글란딘의 큰 클래스는 식별하지만 에이코 사 노이드의 연구는 새로운 발견을위한 충분한 공간이 초기 단계에있다. 여기에서 우리는 프로스타글란딘 및 기타 에이코 사 노이드를 추출하고 분석하기위한 절차를 설명합니다. 청구 지질의는 액체 – 액체 추출 기술을 이용하여 대량의 웜 문화에서 추출 및 전기 분무 이온화 탠덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS/MS)에 결합 액체 크로마토 그래피로 분석됩니다. 이러한 α-D 4 PGF 2와 프로스타글란딘의 중수 아날로그의 포함은 내부 표준 정량 분석을 위해 권장되는. 다중 반응 모니터링이나 MRM은 야생형과 돌연변이 동물 사이의 특정 프로스타글란딘 유형의 양을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 충돌 유발 분해 또는 MS / MS는 중요한 구조적 특징에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 액체 크로마토 그래피 질량 분석기 (LC-MS) 등의 M / Z 315-360로 선택된 질량 범위의 조사 검사는 프로스타글란딘 수준의 글로벌 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 세 가지 분석의 예를 제공합니다. 이러한 방법은 새로운 에이코 사 노이드를 발견하고 자신의 대사 경로 윤곽을위한 도구 세트와 연구자를 제공합니다.
프로스타글란딘은 (PG는) 광범위하게 조사하고 생물 12-14의 넓은 배열에 재생, 면역력, 개발을 규제에 연루되어 지질 호르몬의 중요한 클래스이다. 그들은 공통의 전구체 (들)에서 파생 된 지질의 시리즈를 포함하기 때문에 PG는 이상적으로 포괄적 인 시스템 생물학 분석에 적합합니다. 선충 C. 엘레 간스 유전학 및 시스템 생물학의 근본적인 문제를 해결하기 위해 가장 널리 사용되는 모델 생물 중 하나입니다.
우리는 증명 한 C. 엘레은 F-시리즈 PG는을 합성하는 난자 3,6,16에 운동성 정자 가이드. 각각 셋, 넷, 다섯 이중 결합, F1을 포함, F2, F3 및 클래스, 20 개의 탄소 된 PUFA에서 파생 된 F-시리즈 PG는이 3,16가 확인되었습니다. 이러한 PG는이 cyclooxygenase 효소의 독립적 인 합성, 아직 PGF 1α와 PGF 2α 입체는 여전히 GE있다있다nerated. C.의 정성 및 정량 분석을위한 엘레 PG는이 LC-MS/MS는 강력하고 중요한 분석 기술입니다. 이 분석을 수행하기 전에, 그것은 분석 프로세스의 성능이 크게 추출물의 품질에 의존하기 때문에 최적화 된 추출 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석법은 비 (M / Z)를 충전 할 것으로 예상 질량뿐만 아니라, PG 부모 이온의 바람직한 피크 모양과 체류 시간을 제공 할 수 있습니다. C.에있는 PG는 대사 프로파일 엘레 다양한 MS의 인수 전략을 필요로하는 어려운 작업입니다.
LC-MS 전체 검사 또는 조사 검사 (Q1 검사)는 대부분의 이온화 PG는이 질량 분석 응답을 생성 보장하는 장점이 있습니다. 설문 조사 검사는 야생형과 돌연변이 C.에 대해 PG는 총 프로파일에 대한 유용한 정보를 제공하는 반면 elegans의 사소한 PG는 검출 낮은 민감도로 인해 손상된다. 그러할이하, LC-MS 설문 조사 검색은 PG는의 글로벌 뷰를 제공하고 대형 PG 인구의 신진 대사에 영향을 미칠 것으로 예상 돌연변이 분석에 특히 유용 할 수 있습니다.
대사 산물 식별을 화학적으로 합성 된 PG 표준의 LC-MS/MS 분석은 첫 번째 참조 화합물로 그들의 제품 이온 스펙트럼을 얻기 위해 수행됩니다. 이 스펙트럼은 알 수없는 대사의 스펙트럼을 비교할 수 있습니다. 다중 반응 모니터링 (MRM) 모드는 향상된 민감도와 특이도 사용됩니다. MRM 실험은 화합물의 부모 이온 / 제품 이온 질량 전환을 지정하여 수행됩니다. 대상 분석 물질의 질량과 구조를 알면, 많은 알 수없는 대사에 대한 이론적 인 MRM 전환을 예상 할 수 있습니다.
C.의 이성체 PG는 프로파일에 최적화 된 LC-MS/MS 방법 엘레은보고되지 않았습니다. 여기에서 우리는 LC-MS와 구성된 추출 및 통합 질량 분석 방법을 설명 LC를검출, 정량화, 그리고 C. 조사를위한 MS / MS 방법 엘레 PG 대사. 이 방법은 다른 에이코 사 노이드에 적용 할 수 있습니다.
우리는 F-시리즈 PG는에 초점을 맞추고, eicosanoid 추출 및 분석을위한 절차를 설명합니다. 문제가 될 수 있습니다 절차의 여러 부분이 있습니다. 첫째, 기아 PG 신진 대사를 변경할 수있는 웜 문화, 굶어하지 않는 것이 중요합니다. NA22이 높은 밀도에 도달하기 때문에 보충 수유를 들어, NA22 박테리아는 대신에 일반적으로 사용되는 OP50 박테리아를 권장합니다. 그러나 NA22 변형 항생제 내성이 부족하고 오염에 더 취약하다. 둘째, 웜 포유 동물 조직에 상대적으로 낮은 풍부 개별 PG의 이성질체를 합성. 이 부분에서 많은 이성질체 사이에 중복으로 인해 수 있습니다. 우리는 포괄적 인 분석과 강한 신호를 조직의 약 6 g을 추천합니다. 건조 추출물이 적은 메탄올에 재현 탁 경우 적은 조직 (1-2 g)를 사용할 수 있습니다 : 수용액은 PG 농도를 증가 할 수 있습니다. 그러나, 1-2 주사를 수행 할 수 있습니다. 우리의 LC-MS/MS 시스템의 검출 한계는 10 PG 약PGF 2α / ML. 밀집 혼합 단계 웜 중 하나 ML (약 1 g)는 CePGF2의 약 25-50 PG를 얻을 수 있습니다. 더 민감한 질량 분석 시스템은 분석에 필요한 웜 조직의 양을 줄일 수 있습니다. 셋째, 샘플 간의 PG 추출 효율의 차이는 변수의 결과가 발생할 수 있습니다. 우리는 추출 효율은 조직이 병렬로 추출 할 때 매우 비슷하다는 것을 발견했다. 효율성을 결정하기 위해 내부 통제로 균질화 단계에서 PGF 2α-D 4 1.0 NG를 추가합니다. MRM은 M / Z 197분의 357은 1 NG / ML 표준 용액을 기준으로 PGF 2α-D4의 농도를 측정하는 데 사용되는 질량 전환을 사용하여. 추출하는 동안 손실 PGF 2α-D 4의 양은 다음 계산됩니다.
우리가 포함 크로마토 그래피 매개 변수와 질량 전환은 다른 PG는과 에이코 사 노이드를 감지 변경할 수 있습니다. 상당한 노력에도 불구하고, 우리는 D-시리즈 또는 E-SER을 식별 할 수 없었다이거는 추출물 17 PGS. 또한, 우리는 8 ISO PGF 2α 및 PG 입체 19 비 선택적 혼합물을 생성하는 자유 라디칼 개시 과산화의 특징 인 8-iso로 PGE을 2 발견되지 않았습니다. 웜은 다른 PG 유형을 합성 여부가 알려져 있지 않다. endocannabinoids에와 아라키돈와 에이코 사 펜타 엔 산의 다양한 에폭시 및 히드 록시 대사 C.에서 발견되었습니다 엘레은 5,7,20,21를 추출합니다. 우리는 각각 정량 및 식별에 대한 확실한 기준에 비해 MRM 및 MS / MS 모두의 사용을 권장합니다. 새로운 에이코 사 노이드의 경우, 이러한 분석은 가능하면 효소 22뿐만 아니라, 기능 분석을 합성 PUFA에 부족한 지방 돌연변이의 비교 연구와 결합해야합니다. 지방 돌연변이 분석에주의해야 할 점은 웜에 존재 된 PUFA의 분 수량은 PG 합성에 충분한 것입니다. 예를 들어, 지방 2 (WA17) 돌연변이D12 불포화 활동의 소량 (~ 5 야생형 22 %) 이러한 돌연변이는 여전히 PG는 6을 생산하고 있습니다. 지방 3 (WA22)과 지방-4 (WA14) 돌연변이는 아라키돈와 에이코 사 펜타 엔 산 16에서 파생 된 PG는 합성 실패가 . 우리는 또한 지방 돌연변이가 나머지 클래스의 최대 조절 PG의 합성에 의한 PUFA 클래스의 손실을 보상 나타났습니다. 예를 들어, 지방 3 (WA22) 돌연변이는 20 탄소 된 PUFA에서 파생 된 대부분의 PG는 합성에 실패합니다. 대신, 그들은 18 탄소 된 PUFA 16에서 파생 된 새로운 PG는을 – 조절 나타납니다. 지금까지, 우리는 C를 확인하지 못했습니다 PG 합성에 완전히 부족한 elegans의 변형. 그것은 PG는 성장이나 개발에 필수적인 가능성이 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 UAB 피부 질환 연구 센터 (C. Elmets에 P30 AR050948), UAB-UCSD 오브라이언 급성 신장 손상 센터 (P30 DK079337 A. 아가 왈에 의해 부분적으로 지원되었다 UAB 대상으로 대사와 프로테오믹스 실험실, 감사합니다 )와 UAB 폐 보건소 (R01 HL114439, R01 HL110950 JE 블레이락까지). 질량 분석기에 대한 지원은 NCRR 공유 계측 부여 (S. 반즈에 S10 RR19261)에서 있었다. 우리는 또한 기술 지원을 레이 무어 감사합니다. C. 엘레 균주는 NIH에 의해 자금 지원 Caenorhabditis의 유전학 센터에 의해 제공되었다. 이 작품은 NIH (ARRA 관리 보조 등 R01GM085105에 MAM)에 의해 지원되었다.
REAGENTS | |||||||||||||||||
X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
EQUIPMENT | |||||||||||||||||
CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
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