Neste artigo, descrevemos um procedimento otimizado para a extração e análise de prostaglandinas e outros eicosanóides de<em> C. elegans</em> Utilizando LC-MS/MS.
Caenorhabditis elegans está emergindo como um modelo animal poderoso para estudar a biologia de lipídios 1-9. As prostaglandinas são uma importante classe dos eicosanóides, os quais são sinais de lípidos derivados de ácidos gordos poliinsaturados (PUFAs) 10-14. Estas moléculas de sinalização são difíceis de estudar por causa de sua baixa abundância e natureza reativa. A principal característica das prostaglandinas é uma estrutura em anel ciclopentano localizado dentro da espinha dorsal do ácido gordo. Nos mamíferos, as prostaglandinas podem ser formados através da enzima ciclo-oxigenase-vias dependentes e independentes de 10,15. C. elegans sintetiza um vasto leque de prostaglandinas independentes de cyclooxygenases 6,16,17. A grande classe das prostaglandinas da série F foi identificado, mas o estudo de eicosanóides está em um estágio inicial, com amplo espaço para novas descobertas. Aqui nós descrevemos um método de extracção e análise de prostaglandinas e outros eicosanóides. Lipídico cobrados são extraídas a partir de culturas de vermes em massa utilizando uma técnica de extracção líquido-líquido e analisadas por cromatografia líquida acoplada à tandem com ionização por electrospray, espectrometria de massa (LC-ESI-MS/MS). A inclusão de análogos deuterados de prostaglandinas, tais como PGF 2 α-d 4, como um padrão interno, é recomendado para a análise quantitativa. Monitorização de reacção múltipla ou MRM pode ser utilizado para quantificar e comparar os tipos específicos de prostaglandinas entre os animais do tipo selvagem e mutante. Decomposição induzida por colisão ou MS / MS pode ser utilizada para obter informação sobre as características estruturais importantes. Espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) varreduras de levantamento de uma gama de massa seleccionada, como por exemplo m / z 315-360 pode ser utilizado para avaliar as alterações globais nos níveis de prostaglandinas. Nós fornecemos exemplos de todas as três análises. Esses métodos irão fornecer aos pesquisadores um conjunto de ferramentas para a descoberta de novos eicosanóides e delinear suas vias metabólicas.
As prostaglandinas (PGs) são uma classe importante de hormonas de lípidos que têm sido amplamente investigados e envolvido na regulação da reprodução, imunidade, e desenvolvimento de uma ampla variedade de organismos de 12-14. PGs são idealmente adequados para análises de biologia de sistemas completos, porque eles compreendem uma série de lípidos derivadas de um precursor comum (s). O nemátodo C. elegans é um dos organismos modelo mais utilizados para tratar de questões fundamentais em genética e biologia de sistemas.
Nós demonstramos que o C. elegans sintetiza PGs F-série que guia espermatozóides móveis para oócitos 3,6,16. As PGs F-series derivados de PUFA de 20 carbono com três, quatro e cinco ligações duplas, compreendendo o F1, F2, F3, e as classes, respectivamente, foram identificadas 3,16. Tais PGs são sintetizados independente das enzimas ciclo-oxigenase, ainda PGF estereoisómeros 2α 1α e PGF ainda são generated. Para as análises qualitativas e quantitativas de C. elegans PGs, LC-MS/MS é uma técnica analítica poderosa e sensível. Antes de realizar esta análise, é importante desenvolver um método de extracção optimizado porque o desempenho do processo analítico depende fortemente da qualidade do extracto. A cromatografia líquida e espectrometria de massa pode apenas fornecer a massa prevista para cobrar razão (m / z), bem como a forma de pico desejável, e o tempo de retenção do ião progenitor PG. Perfil metabólico de PGs em C. elegans é uma tarefa desafiadora que exige várias estratégias de aquisição de MS.
LC-MS verificação completa ou pesquisa de varredura (Q1 scanning) tem a vantagem de garantir que os PGs mais ionizáveis irá gerar uma resposta por espectrometria de massa. Enquanto a digitalização levantamento fornece informações úteis sobre o perfil do total de PGs no que diz respeito ao tipo selvagem e mutante C. elegans, a detecção de pequenos PGs está comprometida devido à baixa sensibilidade. Neverthemenos, LC-MS digitalização levantamento pode dar uma visão global das PGs e é particularmente útil para análise de mutantes preditos de afectar o metabolismo de uma grande população de PG.
Na identificação de metabolito, a análise dos padrões de LC-MS/MS PG sintetizados quimicamente é realizada pela primeira vez obter os seus espectros de ião do produto como compostos de referência. Estes espectros pode ser comparado com o espectro de um metabolito desconhecido. Modo de monitoramento de reação múltipla (MRM) é utilizado para maior sensibilidade e especificidade. Um experimento MRM é conseguido através da especificação do ião progenitor / produto de massa de iões de transição de um composto. Ao conhecer a massa e estrutura dos analitos alvo, é possível prever as transições MRM teóricos para diversos metabolitos desconhecidos.
Um método LC-MS/MS optimizado para perfilar PGs isoméricos em C. elegans não foi avaliado. Aqui nós descrevemos uma abordagem integrada de extração e espectrometria de massa composta por LC-MS e LC-MS / MS métodos para detectar, quantificar e investigar C. elegans PG metabólitos. Esta abordagem pode ser aplicada a outros eicosanóides.
Nós descrevemos um procedimento para extração e análise de eicosanóides, com foco em PGs F-series. Existem várias partes do procedimento que pode ser problemático. Em primeiro lugar, é essencial que as culturas sem-fim não ocupem, como a fome pode alterar o metabolismo de PG. Para uma alimentação suplementar, NA22 bactérias são recomendados em vez dos mais comumente usados OP50 bactérias porque NA22 atinge maior densidade. No entanto, a estirpe NA22 carece de resistência aos antibióticos, e é mais susceptível de contaminação. Em segundo lugar, vermes sintetizar isômeros PG individuais em baixa abundância relativa de tecidos de mamíferos. Isto pode ser devido, em parte, à redundância entre os numerosos isómeros. Recomendamos cerca de 6 g de tecido para análise abrangente e sinais mais fortes. Menos de tecido (1-2 g), pode ser usado, se o extracto seco é ressuspenso em menos de metanol: solução de água para aumentar a concentração do PG. No entanto, apenas uma a duas injecções podem ser realizadas. O limite de detecção do nosso sistema LC-MS/MS é de cerca de 10 pgPGF 2α / ml. Um ml de densamente vermes estágio mistos (cerca de 1 g) produz cerca de 25-50 pg de CePGF2. Sistemas de espectrometria de massa mais sensíveis, pode reduzir a quantidade de tecido sem-fim utilizado para análise. Em terceiro lugar, as diferenças na eficiência de extracção PG entre as amostras podem causar resultados variáveis. Verificou-se que a eficiência da extracção é muito semelhante, quando os tecidos são extraídos em paralelo. Para determinar a eficiência, adicionar 1,0 ng de PGF 2α-d 4, no passo de homogeneização, como um controlo interno. Transição MRM utilizando massa m / z 357/197 é utilizado para medir a concentração de PGF 2α-d4 em relação a uma de 1 ng / ml de solução-padrão. É, então, calculado o valor de PGF 2α-d 4 perdida durante a extracção.
Os parâmetros de cromatografia e transições de massa que podem ser alterados incluem detectar outras PGs e eicosanóides. Apesar de um esforço considerável, não temos sido capazes de identificar série D ou E-sers PGS nos extratos 17. Além disso, não ter detectado 8-iso PGF 2α e 8-iso PGE 2, que são característicos de livre peroxidação radical iniciado, o que gera uma mistura não selectiva de PG estereoisômeros 19. Se vermes sintetizar outros tipos de PG não é conhecido. Endocanabinóides e vários epoxi e hidroxilo metabolitos de araquidónico e ácidos eicosapentanóico foram encontradas em C. elegans extrai 5,7,20,21. Recomendamos o uso de ambos MRM e MS / MS em comparação com padrões autênticos para a quantificação e identificação, respectivamente. Para novos eicosanóides, estas análises deve ser combinada com um estudo comparativo dos mutantes de gordura, que são deficientes na síntese de AGPI de 22 enzimas, bem como um ensaio funcional, se possível. A ressalva a analisar os mutantes de gordura é que pequenas quantidades de ácidos graxos poliinsaturados presentes em vermes são suficientes para a síntese de PG. Por exemplo, as gorduras-2 (wa17) mutantestêm uma pequena quantidade de actividade de dessaturase D12 (~ 5% de tipo selvagem 22), e estes mutantes ainda produzem PGs 6. gordura-3 (WA22) e gordura-4 (WA14) mutantes não conseguem sintetizar PGs derivadas araquidónico e ácidos eicosapentanóico 16 . Descobrimos também que os mutantes de gordura para compensar a perda de aulas PUFA por up-regulação da síntese de PG restantes aulas. Por exemplo, a gordura-3 (WA22) mutantes não conseguem sintetizar a maioria das PGs derivadas de PUFAs 20 carbono. Em vez disso, eles parecem-regulam novos PGs derivadas de 18 carbonos PUFAs 16. Até o momento, não temos conhecimento de um C. elegans estirpe que é completamente deficiente na síntese de PG. É possível que PGs são essenciais para o crescimento ou desenvolvimento.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos aos Metabolomics alvo UAB e Laboratório de Proteômica, que foi apoiado em parte pela pele Disease Research Center UAB (P30 AR050948 a C. Elmets), a O'Brien Centro de lesão renal aguda UAB-UCSD (P30 DK079337 para A. Agarwal ) eo Lung Health Center UAB (HL114439 R01, R01 HL110950 para JE Blalock). Suporte para o espectrômetro de massa era de um NCRR Shared Instrumentação subvenção (S10 RR19261 para S. Barnes). Agradecemos também a Ray Moore para suporte técnico. C. cepas elegans foram fornecidos pelo Caenorhabditis Genetics Center, que é financiado pelo NIH. Este trabalho foi financiado pelo NIH (R01GM085105 ao MAM, incluindo um suplemento administrativa ARRA).
REAGENTS | |||||||||||||||||
X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
EQUIPMENT | |||||||||||||||||
CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
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