במאמר זה, אנו מתארים הליך אופטימלי להפקת וניתוח של פרוסטגלנדינים ואחרים מeicosanoids<em> ג elegans</em> באמצעות LC-MS/MS.
elegans Caenorhabditis מתגלה כמודל חיה רב עוצמה כדי לחקור את הביולוגיה של שומני 1-9. פרוסטגלנדינים הם מעמד חשוב של eicosanoids, שהם אותות שומנים שמקורם בחומצות שומן רב בלתי רוויות (PUFAs) 10-14. מולקולות האיתות הללו הן קשים ללמוד בגלל השפע הנמוך שלהם והאופי תגובתי. התכונה האופיינית של פרוסטגלנדינים היא מבנה טבעת cyclopentane ממוקם בתוך עמוד השדרה חומצות השומן. ביונקים, יכולים להיווצר באמצעות פרוסטגלנדינים cyclooxygenase מסלולים ועצמאיים 10,15 אנזים התלויים. ג elegans מסנתז מגוון רחב של פרוסטגלנדינים עצמאיים של cyclooxygenases 6,16,17. מעמד גדול של פרוסטגלנדינים F-Series זוהה, אבל המחקר של eicosanoids הוא בשלב מוקדם עם מספיק מקום לגילויים חדשים. כאן אנו מתארים הליך להפקת וניתוח של פרוסטגלנדינים וeicosanoids אחרים. שומנים טעוניםים מופק מתרבויות תולעת ההמוניות באמצעות טכניקת מיצוי נוזלית נוזלית ונותח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים את electrospray יינון טנדם ספקטרומטריית המסה (LC-ESI-MS/MS). הכללתו של אנלוגים deuterated של פרוסטגלנדינים, כגון PGF 2 α-D 4 כסטנדרט פנימי מומלץ לניתוח כמותי. ניטור תגובה מרובה או MRM יכול לשמש כדי לכמת ולהשוות סוגי פרוסטגלנדין ספציפיים בין חיות בר מסוג והמוטציה. פירוק מושרה מהתנגשות או MS / MS יכול לשמש כדי לקבל מידע על תכונות מבניות חשובות. כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה (LC-MS) סריקות סקר של טווח מסה שנבחר, כגון מ '/ z 315-360 ניתן להשתמש כדי להעריך את השינויים הגלובליים ברמות פרוסטגלנדין. אנו מספקים דוגמאות לכל שלושת הניתוחים. שיטות אלה יספקו לחוקרים עם כלים לגילוי eicosanoids רומן והתוויית המסלולים מטבוליים שלהם.
פרוסטגלנדינים (PGS) הם מעמד חשוב של הורמוני שומנים שנחקרו בהרחבה ומעורבת בויסות רבייה, חסינות, ופיתוח במגוון רחב של אורגניזמים 12-14. PGs מתאים בצורה אידיאלית לניתוחי ביולוגיה מערכות מקיפים משום שהם מהווים סדרה של שומנים שמקורם מבשר נפוצה (ים). נמטודות ג elegans הוא אחד מיצורי המודל הנפוץ ביותר כדי לענות על שאלות בסיסיות בגנטיקה וביולוגיה של מערכות.
אנחנו הוכחנו כי ג elegans מסנתז PGs F-Series שמדריך ניעתי זרע לביציות 3,6,16. PGs F-Series נגזר מPUFAs 20 פחמן עם שלוש, ארבע, וחמישה קשרים כפולים, הכוללים את F1, F2, F3 וכיתות, בהתאמה זוהה 3,16. PGs אלה מסונתזים עצמאי של אנזימי cyclooxygenase, עדיין stereoisomers 2α 1α וPGF PGF עדיין generated. עבור ניתוחים איכותיים וכמותיים של ג elegans PGs, LC-MS/MS הוא טכניקה אנליטית חזקה ורגישה. לפני ביצוע ניתוח זה, חשוב לפתח שיטת חילוץ אופטימלית בגלל ביצועים של התהליך האנליטי תלויים בכבדות על איכות התמצית. כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה יכולות רק לספק המונית צפוי לחייב את היחס (מ '/ z), כמו גם את הצורה רצויה לשיא וזמן שמירה של יון הורה PG. פרופיל מטבולי של PGs בג elegans הוא משימה מאתגרת הדורשת אסטרטגיות רכישת MS שונות.
סריקת סריקה או סקר מלאה LC-MS (סריקת Q1) יש את היתרון של הבטחת PGs ionizable ביותר יגרור תגובת ספקטרומטריה. תוך סריקת הסקר מספקת מידע שימושי על פרופיל כולל של PGs ביחס לפראי סוג ומוטצית ג elegans, גילוי של PGs קטין נפגעת בשל רגישות נמוכה. Nevertheפחות, סריקת סקר LC-MS יכולה לתת ראיה גלובלית של PGS ושימושי במיוחד לניתוח חזו מוטציות משפיעים על חילוף חומרים של אוכלוסיית PG גדולה.
יש להציג התעודה מזהה המטבוליט, ניתוח LC-MS/MS של תקני PG מסונתזים כימי מבוצע ראשון לקבל ספקטרום יון המוצר שלהם כתרכובות התייחסות. ספקטרום אלה יכולים להיות בהשוואה לספקטרום של המטבוליט לא ידוע. ניטור מצב תגובה מרובה (MRM) משמש לרגישות וסגוליות משופרים. ניסוי MRM מושגת על ידי ציון המעבר המוני יון יון / מוצר האב של מתחם. אם ידע את המסה והמבנה של analytes היעד, ניתן לחזות מעברי MRM תיאורטיים למטבוליטים רבים לא ידועים.
שיטת LC-MS/MS מותאמת לפרופיל PGs isomeric בג elegans לא דווח. כאן אנו מתארים חילוץ וגישת ספקטרומטריית מסה משולבת בהיקף של LC-MS וLC-שיטות MS / MS לאיתור, כימות, וחוקר ג מטבוליטים PG elegans. גישה זו יכולה להיות מיושמת על eicosanoids אחר.
אנו מתארים הליך להפקה וניתוח eicosanoid, תוך התמקדות בPGs F-Series. ישנם כמה חלקים של ההליך שיכול להיות בעייתי. ראשית, זה קריטי, כי תרבויות התולעת לא לגווע ברעב, כמו רעב יכול לשנות את חילוף החומרים PG. להזנה משלימה, NA22 חיידקים מומלצים במקום OP50 חיידקים יותר נפוצה בגלל NA22 מגיע צפיפות גבוהה יותר. עם זאת, מתח NA22 חסר עמידות לאנטיביוטיקה והוא רגיש יותר לזיהום. שנית, תולעים לסנתז איזומרים PG בודדים בשפע נמוך יחסית לרקמות יונקים. זה יכול להיות בגלל בחלקו ליתירות בין איזומרים רבים. אנו ממליצים על 6 גרם של רקמה לניתוח מקיף ואותות חזקים יותר. רקמה פחות (1-2 גרם) יכולה לשמש אם התמצית מיובשת היא resuspended בפחות מתנול: פתרון מים כדי להגדיל את ריכוז PG. עם זאת, יכולות להתבצע רק 01:59 זריקות. גבול הגילוי של מערכת LC-MS/MS שלנו הוא כ -10 PGPGF 2α / מ"ל. מ"ל אחד של תולעים בשלבים מעורבים בצפיפות (כ 1 ז) מניב בערך 25-50 PG של CePGF2. מערכות ספקטרומטריית מסה יותר רגישות יכולות להפחית את כמות רקמת תולעת נדרשת לניתוח. שלישית, הבדלים ביעילות שאיבת PG בין דגימות יכולים לגרום לתוצאות משתנות. מצאנו כי יעילות שאיבה דומה מאוד כאשר רקמות המחולצות במקביל. כדי לקבוע את היעילות, להוסיף 1.0 ננוגרם של PGF 2α-D 4 בצעד homogenization כבקרה פנימית. MRM באמצעות מעבר המוני מ '/ z 357/197 משמש למדידת ריכוז PGF 2α-D4 יחסית לng 1 / מיליליטר פתרון סטנדרטי. כמות PGF 2α-D 4 איבד במהלך החילוץ ולאחר מכן מחושבת.
ניתן לשנות את פרמטרי כרומטוגרפיה והמעברים המוניים שכוללים לזהות PGS וeicosanoids אחרים. למרות מאמצים רבים, לא הצליחו לזהות D-סדרה או E-series PGS בתמציות 17. יתר על כן, יש לנו לא זוהה 8-ISO PGF 2α ו8-ISO PGE 2 שאופייניים לחמצון רדיקלי ביוזמת חופשי, אשר יוצר תערובת לא סלקטיבי של PG stereoisomers 19. בין אם תולעים לסנתז סוגי PG אחרים אינו ידוע. Endocannabinoids מטבוליטים אפוקסי והידרוקסי שונים של הארכידונית וחומצות eicosapentaenoic כבר נמצאו בג elegans מחלץ 5,7,20,21. אנו ממליצים על השימוש בשני MRM ו-MS / MS בהשוואה לסטנדרטים אותנטיים לכימות וזיהוי, בהתאמה. לeicosanoids הרומן, צריכים להיות בשילוב עם ניתוחים אלה מחקר השוואתי של מוטציות שומן, שהם חסרים PUFA סינתזה 22 אנזימים, כמו גם assay פונקציונלי, במידת האפשר. אזהרה לניתוח מוטציות שומן היא שהכמויות זעירות של PUFAs בהווה בתולעים מספיקות לסינתזת PG. לדוגמה, בשומן (2 wa17) מוטנטיםיש כמות קטנה של פעילות desaturase D12 (~ 5% מהסוג בר 22) ומוטציות אלה עדיין מייצרים 6 PGs. שומן 3 (wa22) ושומן-4 (wa14) מוטנטים מצליח לסנתז PGs נגזר מהארכידונית וחומצות eicosapentaenoic 16 . אנחנו גם מצאנו כי מוטציות שומן לפצות על האובדן של כיתות PUFA בשיעור של עד ויסות סינתזת PG מכיתות שנותרו. לדוגמה, בשומן 3 (wa22) מוטנטים מצליח לסנתז רוב PGs נגזר מPUFAs 20 פחמן. במקום זאת, הם מופיעים למעלה להסדיר PGs הרומן נגזר מ18 פחמן PUFAs 16. נכון להיום, יש לנו לא זיהינו את ג elegans זן שהוא חסר לחלוטין בסינתזת PG. יתכן כי PGs חיוני לצמיחה או התפתחות.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לmetabolomics UAB ממוקד ומעבדת פרוטאומיקה, אשר כבר נתמך בחלקו על ידי המרכז לחקר מחלות עור UAB (P30 AR050948 לג Elmets), מרכז UAB-UCSD אובריאן אקוטי בכליות הפציעה (P30 DK079337 לא Agarwal ) והמרכז לבריאות ריאות UAB (R01 HL114439, R01 HL110950 לי"א Blalock). תמיכה בספקטרומטר המסה הייתה מNCRR משותף מכשור מענק (S10 RR19261 ס 'ארנס). אנו מודים גם ריי מור לקבלת תמיכה טכנית. ג זני elegans נמסרו על ידי המרכז לגנטיקה Caenorhabditis, אשר ממומן על ידי המכון הלאומי לבריאות. עבודה זו נתמכה על ידי NIH (R01GM085105 לMAM, כולל תוספת מנהלית ערה).
REAGENTS | |||||||||||||||||
X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
EQUIPMENT | |||||||||||||||||
CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
|