Dans cet article, nous décrivons une procédure optimisé pour l'extraction et l'analyse des prostaglandines et autres eicosanoïdes de<em> C. elegans</em> Par LC-MS/MS.
Caenorhabditis elegans est en train de devenir un modèle animal puissant pour étudier la biologie des lipides 1-9. Les prostaglandines sont une classe importante d'eicosanoïdes, qui sont des signaux lipidiques dérivés des acides gras polyinsaturés (AGPI) 10-14. Ces molécules de signalisation sont difficiles à étudier en raison de leur faible abondance et la nature réactive. La caractéristique de prostaglandines est une structure de cycle cyclopentane situé dans le squelette d'acide gras. Chez les mammifères, les prostaglandines peuvent être formés par la cyclo-oxygénase voies et indépendants enzyme dépendant de 10,15. C. elegans synthétise un large éventail de prostaglandines indépendants de cyclooxygenases 6,16,17. Une grande classe des prostaglandines de la série F a été identifié, mais l'étude des eicosanoïdes est à un stade précoce avec amplement d'espace pour de nouvelles découvertes. Nous décrivons ici une méthode pour l'extraction et l'analyse des prostaglandines et autres eicosanoïdes. Lipide chargés sont extraites à partir de cultures de vers de masse à l'aide d'une technique d'extraction liquide-liquide et analysés par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem d'ionisation d'électronébulisation (LC-ESI-MS/MS). L'inclusion d'analogues deutérés de prostaglandines, comme PGF 2 α-D 4 en tant que norme interne est recommandé pour l'analyse quantitative. Suivi de réactions multiples ou MRM peuvent être utilisés pour quantifier et comparer les types de prostaglandines spécifiques entre les animaux de type sauvage et mutant. Décomposition induite par collision ou MS / MS peuvent être utilisés pour obtenir des informations sur les caractéristiques structurelles importantes. Spectrométrie de masse chromatographie liquide (LC-MS) scans de l'enquête d'une gamme sélectionnée de masse, tels que m / z 315-360 peut être utilisé pour évaluer les changements globaux des niveaux de prostaglandine. Nous fournissons des exemples de ces trois analyses. Ces méthodes permettront aux chercheurs un ensemble d'outils pour la découverte de nouveaux eicosanoïdes et de délimiter leurs voies métaboliques.
Les prostaglandines (PG) sont une classe importante d'hormones lipidiques qui ont été largement étudiés et impliqués dans la régulation de la reproduction, l'immunité et le développement dans un large éventail d'organismes 12-14. PG sont idéales pour les systèmes analyses approfondies de la biologie, car ils comprennent une série de lipides issus d'un précurseur commun (s). Le nématode C. elegans est l'un des organismes modèles les plus largement utilisés pour répondre aux questions fondamentales de la génétique et de la biologie des systèmes.
Nous avons démontré que C. elegans synthétise PG F-series qui guident spermatozoïdes mobiles des ovocytes 3,6,16. PG F-séries dérivées des AGPI 20 carbone avec trois, quatre, et cinq doubles liaisons, comprenant la F1, F2, F3 et des classes, respectivement ont été identifiés 3,16. Ces PG sont synthétisés indépendant des enzymes de cyclooxygénase, encore PGF 2α 1α stéréo et PGF sont encore getransporteur est également exonéré. Pour les analyses qualitatives et quantitatives de C. elegans PG, LC-MS/MS est une technique d'analyse puissante et sensible. Avant de procéder à cette analyse, il est important de développer une méthode d'extraction optimisé car la performance du processus d'analyse dépend fortement de la qualité de l'extrait. Chromatographie liquide et la spectrométrie de masse ne peuvent fournir de masse prévu sur charge (m / z), ainsi que la forme du pic souhaitable et temps de rétention de l'ion parent PG. Le profilage métabolique des PG en C. elegans est une tâche difficile nécessitant diverses stratégies d'acquisition MS.
Analyse complète ou une enquête balayage LC-MS (Q1 balayage) a l'avantage de garantir que les PG plus ionisables vont générer une réponse par spectrométrie de masse. Bien que l'analyse de l'enquête fournit des renseignements utiles sur le profilage total de PG par rapport au type sauvage et mutant C. elegans, la détection des PG mineurs sont compromises en raison d'une faible sensibilité. Néanmoinsmoins, l'analyse LC-MS enquête peut donner une vue globale des PG et est particulièrement utile pour l'analyse des mutants prévus pour affecter le métabolisme d'une grande population de PG.
Dans l'identification des métabolites, l'analyse CPL-SM/SM de normes de PG synthétisés par voie chimique est d'abord effectuée pour obtenir leurs spectres d'ions produit en tant que composés de référence. Ces spectres peut être comparé au spectre d'un métabolite inconnu. Mode de suivi de réactions multiples (MRM) est utilisé pour améliorer la sensibilité et la spécificité. Une expérience MRM est accomplie en spécifiant le passage de masse des ions ions / produit d'un composé parent. En connaissant la masse et de la structure des analytes cibles, il est possible de prévoir des transitions MRM théoriques pour de nombreux métabolites inconnus.
Une méthode LC-MS/MS optimisé pour le profilage PG isomères dans C. elegans n'a pas été signalée. Nous décrivons ici une extraction et une approche intégrée de la spectrométrie de masse constitué de LC-MS et LC-Méthodes MS / MS pour la détection, la quantification et l'investigation C. elegans métabolites p. Cette approche peut être appliquée à d'autres eicosanoïdes.
Nous décrivons une procédure d'extraction et d'analyse des eicosanoïdes, en se concentrant sur PG F-series. Il ya plusieurs parties de la procédure qui peut être problématique. Tout d'abord, il est essentiel que les cultures de vers ne meurent pas de faim, que la famine peut modifier le métabolisme PG. Pour une alimentation d'appoint, NA22 bactéries sont recommandés au lieu de les OP50 bactéries les plus couramment utilisés car NA22 atteint une densité plus élevée. Cependant, la souche NA22 manque de résistance aux antibiotiques et est plus sensible à la contamination. Deuxièmement, les vers synthétisent isomères PG individuels faible abondance relative de tissus de mammifères. Cela peut être dû en partie à la redondance parmi les nombreux isomères. Nous vous recommandons d'environ 6 g de tissu pour analyse complète et des signaux plus forts. Moins de tissu (1-2 g) peut être utilisé si l'extrait séché est remis en suspension dans moins de méthanol: solution d'eau pour augmenter la concentration PG. Toutefois, seulement une à deux injections peuvent être réalisées. La limite de détection de notre système LC-MS/MS est d'environ 10 pgPGF 2α / ml. Un ml de vers de scène mixtes denses (environ 1 g), on obtient à peu près 25-50 pg de CePGF2. Des systèmes de spectrométrie de masse plus sensibles peuvent réduire la quantité de tissu à vis sans fin utilisé pour l'analyse. Troisièmement, les différences de rendement d'extraction PG parmi les échantillons peuvent provoquer des résultats variables. Nous avons constaté que l'efficacité d'extraction est très similaire lorsque les tissus sont extraits en parallèle. Pour déterminer l'efficacité, ajoutez 1,0 ng de PGF 2α-d 4 à l'étape d'homogénéisation comme un contrôle interne. MRM aide de transition de masse m / z 357/197 est utilisé pour mesurer la concentration PGF 2α-d4 par rapport à un 1 ng / ml de solution étalon. Le montant de la PGF 2α-d4 perdu lors de l'extraction est ensuite calculée.
Les paramètres de chromatographie et les transitions de masse nous incluons peuvent être modifiés pour détecter d'autres PG et eicosanoïdes. Malgré des efforts considérables, nous n'avons pas été en mesure d'identifier la série D ou E-SERs PGS dans les extraits 17. En outre, nous n'avons pas détecté 8-iso PGF 2α et 8-iso PGE 2 qui sont caractéristiques de la libre peroxydation initiée par des radicaux, ce qui génère un mélange non sélectif de PG stéréo 19. Que ce soit vers synthétisent les autres types de PG n'est pas connue. Les endocannabinoïdes et divers époxy et hydroxy métabolites des acides arachidonique et eicosapentaénoïque ont été trouvés dans C. elegans extrait 5,7,20,21. Nous recommandons l'usage du MRM et MS / MS par rapport aux normes authentiques de quantification et d'identification, respectivement. Pour nouveaux eicosanoïdes, ces analyses devraient être combinées avec une étude comparative des mutants graisseuses, qui sont déficients en AGPI synthétiser des enzymes 22, ainsi que d'une analyse fonctionnelle, si possible. Une mise en garde à l'analyse de mutants graisse est que d'infimes quantités d'AGPI présents dans les vers sont suffisantes pour la synthèse des PG. Par exemple, les matières grasses (2 wa17) mutantsune petite quantité d'activité désaturase D12 (~ 5% de type sauvage 22) et ces mutants produisent encore PG 6. gras-3 (WA22) et de la graisse-4 (WA14) des mutants ne parviennent pas à synthétiser PG dérivés d'acides arachidonique et eicosapentaénoïque 16 . Nous avons également constaté que les mutants gras compenser la perte des classes AGPI jusqu'à réglementer la synthèse de PG de classes restantes. Par exemple, la graisse 3 (WA22) mutants ne parviennent pas à synthétiser la plupart des dérivés de PG AGPI 20-carbone. Au lieu de cela, ils semblent mettre à réguler nouveaux PG issus de 18 atomes de carbone AGPI 16. À ce jour, nous n'avons pas identifié un C. souche elegans qui est complètement déficiente dans la synthèse des PG. Il est possible que les PG sont essentiels pour la croissance ou le développement.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les métabolomique ciblée UAB et de laboratoire de protéomique, qui a été financé en partie par la peau Disease Research Center UAB (P30 AR050948 à C. Elmets), le O'Brien Centre de lésions rénales aiguës UAB-UCSD (P30 DK079337 à A. Agarwal ) et l'UAB Lung Health Center (R01 HL114439, HL110950 R01 à JE Blalock). Soutien à la spectrométrie de masse était d'une NCRR partagée subvention Instrumentation (S10 RR19261 à S. Barnes). Nous remercions également Ray Moore pour le support technique. C. souches elegans ont été fournies par le Centre de génétique Caenorhabditis, qui est financé par le NIH. Ce travail a été soutenu par le NIH (R01GM085105 de MAM, y compris un supplément administratif ARRA).
REAGENTS | |||||||||||||||||
X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
EQUIPMENT | |||||||||||||||||
CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
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