In dit artikel beschrijven we een geoptimaliseerd voor de extractie en analyse van prostaglandines en andere eicosanoïden uit<em> C. elegans</em> Gebruik van LC-MS/MS.
Caenorhabditis elegans is in opkomst als een krachtig diermodel om de biologie van lipiden 1-9 te bestuderen. Prostaglandinen zijn een belangrijke klasse van eicosanoïden die lipide signalen afgeleid van meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA) 10-14 zijn. Deze signaalmoleculen zijn moeilijk te bestuderen vanwege hun lage overvloed en reactief karakter. Kenmerkend prostaglandinen een cyclopentaanring structuur binnen de vetzuur backbone. In zoogdieren kan prostaglandines worden gevormd door cyclooxygenase enzym-afhankelijke en-onafhankelijke routes 10,15. C. elegans synthetiseert een breed scala van prostaglandines onafhankelijk van cyclooxygenases 6,16,17. Een grote klasse van F-serie prostaglandines is geïdentificeerd, maar de studie van eicosanoïden is in een vroeg stadium met veel ruimte voor nieuwe ontdekkingen. Hier beschrijven we een werkwijze voor de extractie en analyse van prostaglandinen en andere eicosanoïden. Geladen lipides worden uit massa worm kweken met een vloeistof-vloeistof extractie techniek en geanalyseerd door vloeistofchromatografie gekoppeld met electrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS). De opname van gedeutereerde analogen van prostaglandinen, zoals PGF 2 α-d 4 als interne standaard wordt aanbevolen voor kwantitatieve analyse. Multiple Reaction Monitoring of MRM kunnen worden gebruikt te kwantificeren en te vergelijken specifieke typen prostaglandine tussen wild-type en mutante dieren. Botsingsgeïnduceerde afbraak of MS / MS kan worden gebruikt om informatie te verkrijgen over belangrijke structurele kenmerken. Vloeistofchromatografie massaspectrometrie (LC-MS) onderzoek scans van een geselecteerd massabereik, zoals m / z 315-360 kan worden gebruikt om globale veranderingen in prostaglandine niveau te beoordelen. We geven voorbeelden van alle drie analyses. Deze methoden zullen onderzoekers te voorzien van een toolset voor het ontdekken van nieuwe eicosanoïden en de afbakening van hun metabole routes.
Prostaglandines (PG's) zijn een belangrijke klasse van lipiden hormonen die zijn uitgebreid onderzocht en betrokken is bij de voortplanting, immuniteit, en ontwikkeling in een breed scala van organismen 12-14. PG zijn ideaal voor uitgebreide systemenbiologie gevolgd omdat ze een serieschakeling van lipiden afkomstig uit een gemeenschappelijke precursor (s). De nematode C. elegans is een van de meest gebruikte modelorganismen om fundamentele vragen in de genetica en systeembiologie pakken.
We hebben aangetoond dat C. elegans synthetiseert F-serie PG's die gids beweeglijk sperma aan eicellen 3,6,16. F-series PG afgeleid van 20-carbon PUFA met drie, vier en vijf dubbele bindingen, omvattende de F1, F2 en F3 respectievelijk de klasse geïdentificeerd 3,16. De PG's worden onafhankelijk van cyclooxygenase enzymen gesynthetiseerd, maar PGF 1α en PGF 2α stereoisomeren steeds gevergoede. Kwalitatieve en kwantitatieve analyses van C. elegans PG, LC-MS/MS is een krachtige en gevoelige analytische techniek. Voordat deze analyse is het belangrijk om een optimale extractie method Doordat de performance van het analyseproces sterk afhankelijk van de kwaliteit extract. Vloeistofchromatografie en massaspectrometrie kan alleen voorzien massa-verhouding (m / z) belasten, en wenselijk piekvorm en de retentietijd van de PG moederion. Metabool profiel van PG's in C. elegans is een uitdagende taak die verschillende MS overnamestrategieën.
LC-MS volledige scan of survey scanning (Q1 scanning) heeft het voordeel dat de meeste ioniseerbaar PG een massaspectrometrische respons te genereren. Terwijl de enquête scan geeft nuttige informatie over de totale profilering van PG's met betrekking tot wild-type en mutant C. elegans, detectie van kleine PGs wordt gecompromitteerd vanwege een lage gevoeligheid. Toch voorminder, kan LC-MS onderzoek scanning een algemeen beeld geven van PG en is bijzonder nuttig voor het analyseren mutanten voorspeld metabolisme van een grote PG bevolking treffen.
In metaboliet identificatie, wordt LC-MS/MS analyse van chemisch gesynthetiseerde PG normen eerst uitgevoerd om hun product ion spectra te verkrijgen als referentie verbindingen. Deze spectra kunnen worden vergeleken met het spectrum van een onbekende metaboliet. Monitormodus Multiple reactie (MRM) wordt gebruikt voor verhoogde gevoeligheid en specificiteit. Een MRM experiment wordt bereikt door het specificeren van de ouder-ion / product ionenmassa overgang van een verbinding. Door te weten de massa en de structuur van de doelanalyten, kan men theoretisch MRM overgangen voorspeld voor vele onbekende metabolieten.
Een geoptimaliseerde LC-MS/MS methode voor het profileren van isomere PG's in C. elegans is niet gemeld. Hier beschrijven we een extractie-en geïntegreerde massaspectrometrie aanpak bestaande uit LC-MS en LC-MS / MS methoden voor het opsporen, kwantificeren en onderzoekt C. elegans PG metabolieten. Deze benadering kan worden toegepast op andere eicosanoïden.
We beschrijven een procedure voor eicosanoid extractie en analyse, gericht op de F-serie PG's. Er zijn verschillende delen van de procedure die kan problematisch zijn. Ten eerste, is het essentieel dat de worm culturen niet verhongeren, zoals honger kan PG metabolisme te veranderen. Voor aanvullende voeding, worden NA22 bacteriën in plaats van de meer algemeen gebruikte OP50 bacteriën aanbevolen omdat NA22 bereikt hogere dichtheid. De NA22 stam mist antibioticaresistentie en is vatbaar voor besmetting. Ten tweede, wormen synthetiseren individuele PG isomeren in geringe hoeveelheden in verhouding tot zoogdierweefsels. Dit kan deels te wijten aan redundantie onder de talrijke isomeren. Wij adviseren ongeveer 6 g weefsel voor een uitgebreide analyse en sterkere signalen. Minder weefsel (1-2 g) kan worden gebruikt als de droge stof wordt opnieuw gesuspendeerd in minder methanol: water oplossing PG concentratie verhogen. Echter, slechts een tot twee injecties worden uitgevoerd. De detectielimiet van LC-MS/MS ons systeem is ongeveer 10 pgPGF 2α / ml. Een ml gemengde dicht op elkaar gepakte stadium wormen (ongeveer 1 g) levert ongeveer 25-50 pg van CePGF2. Meer gevoelige massaspectrometrie systemen kunnen de hoeveelheid worm weefsel nodig voor de analyse te beperken. Ten derde kunnen verschillen in extractie-efficiëntie onder PG monsters variabele resultaten opleveren. Wij hebben gevonden dat extractie efficiëntie vergelijkbaar wanneer weefsels worden geëxtraheerd in parallel. Om de efficiëntie te bepalen, voeg 1,0 ng PGF 2α-d 4 aan de homogenisatiestap als een interne controle. MRM overgang met massa m / z 357/197 wordt gebruikt om PGF 2α-d4 concentratie ten opzichte van een 1 ng / ml standaardoplossing meten. De hoeveelheid PGF 2α-d 4 verloren tijdens extractie wordt berekend.
De parameters chromatografie en massa overgangen we opnemen kan worden aangepast aan andere PG en eicosanoïden detecteren. Ondanks aanzienlijke inspanningen, hebben wij niet in staat om D-serie of E-ser identificerenies PGS in de extracten 17. Bovendien hebben we ontdekt 8-iso PGF 2α en 8-iso PGE2 die kenmerkend vrije radicalen geïnitieerde peroxidatie, die een selectieve mengsel van stereoisomeren PG 19 genereert. Of wormen synthetiseren andere PG is niet bekend. Endocannabinoids en diverse epoxy en hydroxy metabolieten van arachidonzuur en eicosapentaeenzuur zuren gevonden in C. elegans haalt 5,7,20,21. Wij raden het gebruik van zowel MRM en MS / MS in vergelijking met authentieke standaarden voor kwantificering en identificatie, respectievelijk. Van nieuwe eicosanoïden, moet deze analyses worden aangevuld met een studie van vet mutanten die deficiënt zijn in PUFA synthetiserende enzymen 22, alsmede een functionele assay, indien mogelijk. Een waarschuwing voor de analyse van vetten mutanten is dat kleine hoeveelheden PUFA's aanwezig in wormen zijn voldoende voor PG-synthese. Bijvoorbeeld, vet-2 (wa17) mutanteneen kleine hoeveelheid D12 desaturaseactiviteit (~ 5% van de wild type 22) en deze mutanten produceren nog PG 6. vet-3 (WA22) en vet-4 (WA14) mutanten niet PG afgeleid van arachidonzuur en eicosapentaeenzuur zuren 16 synthetiseren . We hebben ook ontdekt dat vet mutanten compenseren voor het verlies van PUFA klassen door up-reguleren PG synthese van de resterende lessen. Bijvoorbeeld, vet-3 (WA22) mutanten niet aan de meeste PGs afgeleid van 20-koolstof PUFA synthetiseren. In plaats daarvan, ze lijken te up-reguleren roman PGs afgeleid van 18-koolstof PUFA 16. Tot op heden hebben we niet geïdentificeerd een C. elegans stam die volledig deficiënt is in PG-synthese. Het is mogelijk dat PG essentieel zijn voor groei of ontwikkeling.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de UAB Gerichte Metabolomics en Proteomics Laboratorium, dat is mede ondersteund door de UAB Skin Disease Research Center (P30 AR050948 naar C. Elmets), de UAB-UCSD O'Brien Acute Kidney Injury Center (P30 DK079337 naar A. Agarwal ) en de UAB Lung Health Center (R01 HL114439, R01 HL110950 tot JE Blalock). Steun voor de massaspectrometer was van een NCRR Shared Bezetting subsidie (S10 RR19261 naar S. Barnes). We danken ook Ray Moore voor technische ondersteuning. C. elegans stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door de NIH. Dit werk werd ondersteund door NIH (R01GM085105 naar MAM, waaronder een ARRA administratief supplement).
REAGENTS | |||||||||||||||||
X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
EQUIPMENT | |||||||||||||||||
CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
|