Summary

Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Published: February 15, 2012
doi:

Summary

Microbiële biofilms zijn over het algemeen gevormd door verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen. Eencellige analyse van deze subpopulaties vereist het gebruik van fluorescerende reporters. Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren en controleren meerdere subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biofilms met behulp van fluorescentie microscopie en flowcytometrie.

Abstract

Vorming van biofilm is een algemene eigenschap van bijna alle bacteriën 1-6. Wanneer bacteriën biofilms vormen, cellen zijn ingekapseld in extracellulaire matrix die meestal wordt gevormd door eiwitten en exopolysacchariden, naast andere factoren 7-10. De microbiële gemeenschap ingekapseld in de biofilm vaak toont de differentiatie van verschillende subpopulatie van gespecialiseerde cellen 11-17. Deze subpopulaties bestaan ​​naast elkaar en vertonen vaak ruimtelijke en temporele organisatie binnen de biofilm 18-21.

Biofilmvorming in het model organisme Bacillus subtilis vereist dat de differentiatie van de verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen. Onder hen, de subpopulatie van matrix producenten, verantwoordelijk voor het produceren en afscheiden van de extracellulaire matrix van de biofilm is essentieel voor biofilmvorming 11,19. Vandaar dat differentiatie van de matrix producenten is een kenmerk van biofilmvorming in B. subtilis.

We hebben fluorescerende verslaggevers voor het visualiseren en kwantificeren van de subpopulatie van matrix producenten in biofilms van B. subtilis 15,19,22-24. Concreet, hebben wij waargenomen dat de subpopulatie van matrix producenten maakt in reactie op de aanwezigheid van zelf geproduceerde extracellulaire signaal surfactin 25. Interessant is surfactin door een subpopulatie van gespecialiseerde cellen verschillend van de subpopulatie van matrix producenten 15.

We hebben beschreven in dit rapport de technische benadering nodig is om te visualiseren en kwantificeren van de subpopulatie van matrix producenten en surfactin producenten binnen de biofilms van B. subtilis. Om dit te doen, zijn TL-verslaggevers van genen die nodig zijn voor matrix productie en surfactin productie ingebracht in het chromosoom van B. subtilis. Reporters worden uitgedrukt slechts in een subpopulatie van gespecialiseerde cellen. Vervolgens kan de subpopulaties zijngecontroleerd met behulp van fluorescentie microscopie en flowcytometrie (zie afb. 1).

Het feit dat verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen naast elkaar bestaan ​​binnen meercellige gemeenschappen van bacteriën geeft ons een ander perspectief over de regulatie van genexpressie bij prokaryoten. Dit protocol heeft betrekking op dit fenomeen experimenteel en kan eenvoudig worden aangepast aan elke andere bewerkingen model, om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan fenotypische heterogeniteit binnen een microbiële gemeenschap toe te lichten.

Protocol

1. Labeling B. subtilis en biofilmvorming Assay Versterken door PCR van de promoter van het gen van belang. We tonen als voorbeeld het klonen van P TAPA, de promotor van de genen voor de productie van TASA matrix eiwit 26. Clone P tapa in pkm008 vector (gemaakt door de Rudner lab, Harvard Medical School. Boston, USA) (fig. 2). Lineariseren de plasmiden door enzymatische digestie (Enzyme aanbevolen, Xhol). Laten natuurlijke compete…

Discussion

Dat bacteriële subpopulaties van cellen die specifieke set van genen bewijzen de complexiteit van microbiële 33,34 weergegeven. Dit protocol zou te bepalen of de expressie van een gen van belang wordt beperkt tot een bepaald subpopulatie van gespecialiseerde cellen in de microbiële. Visualisatie van deze subpopulaties vereist de ontwikkeling van nieuwe technieken, omdat de traditionele methoden om de gen-expressie of microarray analyse beoordeling van de niveaus van genexpressie om de hele microbiële geme…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt gefinancierd door de Young Investigator Research Program, van het Centrum voor Infectieziekten Onderzoek (ZINF) van de Universiteit van Würzburg. Juan C Garcia-Betancur is een PhD fellow van de Graduate School of Life Sciences (GSLS) van de Universiteit van Würzburg.

Materials

Technique Name of the reagent Company Catalog number
MSgg composition potassium phosphate 5mM Roth 6878
MOPS 100mM Sigma-Aldrich M1254
Magnesium chloride 2mM Roth 2189.1
Calcium chloride 700μM Roth A119.1
Ferric chloride 50μM Sigma-Aldrich 157740
Zinc chloride 1μM Applichem A2076
Thiamine 2μM Sigma-Aldrich 74625
Glycerol 0.5% Roth 7533
Glutamate 0.5% Sigma-Aldrich 49621
Tryptophan 50μg/ml Sigma-Aldrich T0254
Phenylalanine 50μg/ml Sigma-Aldrich P2126
Cell fixation Paraformaldehyde Roth 0335
Name of the equipment Company Catalog number
Sonication Cell Sonicator Bandelin D-1000
Fluorescence Microscopy Fluorescence Microscope Leica DMI6000B
Name of the software Company Catalog Number
Fluorescence Microscopy AsaF Leica
Flow cytometry FCASDiva BD
Flow cytometry FlowJo Treestar

References

  1. Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).
  2. Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).
  3. Kolenbrander, P. E. Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems. Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).
  4. O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
  5. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).
  6. Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Biofilms. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).
  7. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  8. Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
  9. Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. Biofilm-associated proteins. C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).
  10. O’Gara, J. P. ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).
  11. Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).
  12. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).
  13. Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation. PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).
  14. Kearns, D. B., Losick, R. Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis. Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).
  15. Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Paracrine signaling in a bacterium. Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).
  16. Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).
  17. Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media. J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).
  18. Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).
  19. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, 945-953 (2008).
  20. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).
  21. Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
  22. Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms. MBio. 1, (2010).
  23. Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).
  24. Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).
  25. Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).
  26. Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
  27. Hardwood, C. R., Cutting, S. M. . Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
  28. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).
  29. Yasbin, R. E., Young, F. E. Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1. J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).
  30. Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).
  31. Nakano, M. M. srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).
  32. Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. Cannibalism by sporulating bacteria. Science. 301, 510-513 (2003).
  33. Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).
  34. Shapiro, J. A. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).

Play Video

Cite This Article
Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796, doi:10.3791/3796 (2012).

View Video