Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie
Summary
Mikrobielle Biofilme sind in der Regel bestehend aus Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Einzelzell-Analyse dieser Subpopulationen setzen die Verwendung von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu visualisieren und überwachen mehrere subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biofilmen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie.
Abstract
Biofilm-Bildung ist ein allgemeines Attribut auf fast allen Bakterien 6.1. Wenn Bakterien Biofilme zu bilden, sind Zellen, in der extrazellulären Matrix, die hauptsächlich gebildet wird von Proteinen und Exopolysacchariden, neben anderen Faktoren 7-10 umhüllt. Die mikrobielle eingeschlossen innerhalb der Biofilme häufig zeigt die Differenzierung von unterschiedlichen Subpopulation von spezialisierten Zellen 11-17. Diese Subpopulationen koexistieren und zeigen oft räumliche und zeitliche Organisation innerhalb des Biofilms 18-21.
Biofilm-Bildung in den Modellorganismus Bacillus subtilis erfordert die Differenzierung von Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Unter ihnen ist die Subpopulation der Matrix Hersteller verantwortlich zu produzieren und sezernieren die extrazelluläre Matrix des Biofilms wesentlichen für die Biofilmbildung 11,19. Daher ist die Differenzierung von Matrix-Produzenten ein Markenzeichen der Biofilmbildung bei B. subtilis.
Wir haben fluoreszierenden Reporter zur Visualisierung und Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Produzenten in Biofilmen von B. subtilis 15,19,22-24. Konkret haben wir beobachtet, dass die Subpopulation der Matrix Hersteller in Reaktion auf das Vorhandensein von selbst produzierten extrazelluläres Signal Surfactin 25 unterscheidet. Interessanterweise wird Surfactin von einer Subpopulation von spezialisierten Zellen unterscheidet sich von der Subpopulation von Matrix 15 Herstellern produziert.
Wir haben in diesem Bericht die technischen Ansatz notwendig, visualisieren und quantifizieren die Subpopulation von Matrix-Produzenten und Surfactin Produzenten innerhalb der Biofilme von B. subtilis beschrieben. Um dies zu tun, sind fluoreszierende Reporter von Genen für Matrix-Produktion und die Produktion benötigten Surfactin in das Chromosom von B. eingefügt subtilis. Reporter werden nur in einer Subpopulation von spezialisierten Zellen exprimiert. Dann können die Subpopulationenüberwacht mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie (siehe Abb. 1).
Die Tatsache, dass unterschiedliche Subpopulationen von spezialisierten Zellen in vielzelligen Gemeinschaften von Bakterien koexistieren gibt uns eine andere Perspektive über die Regulation der Genexpression in Prokaryoten. Dieses Protokoll befasst sich mit diesem Phänomen experimentell und es kann leicht zu einer anderen Arbeits-Modell angepasst werden, um die molekularen Mechanismen der phänotypischen Heterogenität innerhalb einer mikrobiellen Gemeinschaft aufzuklären.
Protocol
Discussion
Die Tatsache, dass bakterielle Gemeinschaften Subpopulationen von Zellen, die bestimmte Gruppe von Genen, beweist die Komplexität mikrobieller Gemeinschaften 33,34 zeigen. Dieses Protokoll soll helfen, festzustellen, ob die Expression eines beliebigen Gens von Interesse für eine bestimmte Subpopulation von spezialisierten Zellen innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft beschränkt. Die Visualisierung dieser Subpopulationen erfordert die Entwicklung neuer Techniken, da herkömmliche Methoden Genexpression ode…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von den Young Investigator Research Program gefördert, vom Zentrum für Infektionsforschung (zinf) von der Universität Würzburg. Juan Garcia-C Betancur ist ein Doktorand von der Graduate School of Life Sciences (GSLS) der Universität Würzburg.
Materials
| Technique | Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MSgg composition | potassium phosphate 5mM | Roth | 6878 |
| MOPS 100mM | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Magnesium chloride 2mM | Roth | 2189.1 | |
| Calcium chloride 700μM | Roth | A119.1 | |
| Ferric chloride 50μM | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Zinc chloride 1μM | Applichem | A2076 | |
| Thiamine 2μM | Sigma-Aldrich | 74625 | |
| Glycerol 0.5% | Roth | 7533 | |
| Glutamate 0.5% | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| Tryptophan 50μg/ml | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| Phenylalanine 50μg/ml | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Cell fixation | Paraformaldehyde | Roth | 0335 |
| Name of the equipment | Company | Catalog number | |
| Sonication | Cell Sonicator | Bandelin | D-1000 |
| Fluorescence Microscopy | Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000B |
| Name of the software | Company | Catalog Number | |
| Fluorescence Microscopy | AsaF | Leica | |
| Flow cytometry | FCASDiva | BD | |
| Flow cytometry | FlowJo | Treestar |
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