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면역학 및 감염병학

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis Biofilms

Published: February 15, 2012
doi:
10.3791/3796
, , ,
1Institute for Molecular Infection Biology (IMIB),University of Würzburg

Summary

미생물 biofilms은 일반적으로 전문의 세포 독특한 subpopulations에 의해 형성된다. 이러한 subpopulations의 단일 세포 분석은 형광 기자의 사용을 필요로합니다. 여기 몇 가지 subpopulationswithin을 시각화하고 모니터하는 프로토콜을 설명<em> B. subtilis</em> 형광 현미경 및 유동세포계측법을 사용 biofilms.

Abstract

Biofilm 형성은 거의 모든 박테리아 1-6에 일반 속성입니다. 박테리아가 biofilms를 형성하면, 전지는 주로 7-10 기타 요인 중에서 단백질과 exopolysaccharides에 의해 형성되는 세포외 기질에 쌌다 있습니다. 미생물 커뮤니티는 종종 11-17 특화된 세포의 뚜렷한 subpopulation의 분화를 보여줍니다 biofilm 내에서 이탈식. 이러한 subpopulations가 공존하며 종종 biofilm 18-21 사이 공간과 시간적 조직을 보여줍니다.

모델 유기체 바실러스 subtilis의 Biofilm 형성은 전문적인 세포의 뚜렷한 subpopulations의 분화가 필요합니다. 그중 biofilm의 세포외 기질을 생산하고 분비하는 책임 매트릭스 제작자의 subpopulation는 biofilm 형성 11,19 위해 필수적입니다. 따라서 매트릭스 생산자의 차별화는 B에 biofilm 형성에 각인되어있는 것입니다 subtilis.

우리는 B.의 biofilms에서 매트릭스 생산 subpopulation을 시각화하고 수치 형광 기자를 사용한 subtilis 15,19,22-24. 구체적으로, 우리는 매트릭스 생산 subpopulation 자기 생산 세포 신호 surfactin 25 존재에 대한 응답으로 차별화 것을 관찰했습니다. 흥미롭게도 surfactin는 매트릭스 생산자 15 subpopulation과 다른 특수 세포 subpopulation에 의해 생산됩니다.

우리는이 보고서 바실러스 subtilis의 biofilms 이내 매트릭스 생산자와 surfactin 생산자의 subpopulation을 시각화하고 계량하는 데 필요한 기술적인 접근 방식에 자세히 있습니다. 이렇게하려면 행렬 생산 및 surfactin 생산에 필요한 유전자의 형광 기자 B.의 염색체에 삽입됩니다 subtilis. 기자는 전문화된 세포 subpopulation에 표현됩니다. 다음 subpopulations가 될 수 있습니다형광 현미경 및 유동세포계측법합니다 (그림 1 참조)을 사용하여 모니터.

전문 세포의 다른 subpopulations는 박테리아의 다세포 지역 사회 내에 공존한다는 사실은 우리에게 prokaryotes의 유전자 발현의 조절에 대해 다른 관점을 제공합니다. 이 프로토콜은 실험적으로 이러한 현상을 해결하고 쉽게 미생물 지역 사회 내에서 phenotypic 이질의 기본 분자 메커니즘을 명료하게하다하기 위해 다른 작업 모델에 적용할 수 있습니다.

Protocol

1. 레이블 B. subtilis 및 Biofilm 형성 분석 PCR에 의해 관심 유전자의 프로 모터 영역을 확대. 우리는 예로 P tapA, TasA 매트릭스 단백질 26 생산을 담당하는 유전자의 프로 모터의 복제를 보여줍니다. pkm008 벡터 (Rudner 연구소, 하버드 의과 대학. 보스톤, 미국에서 만든)로 클론 P tapA (그림 2). 효소 소화 (효소 권장, XhoI)에 의해 plasmids을 Linearize. </l…

Discussion

세균성 커뮤니티 유전자 증거 미생물 커뮤니티 33,34의 복잡의 특정 집합을 표현하는 세포의 subpopulations 보여주는 사실. 이 프로토콜은 관심사의 유전자의 표현이 미생물 지역 사회 내에서 전문화된 세포의 특정 subpopulation로 제한 여부를 확인하는 데 도움이됩니다. 전통적인 방법은 전체 미생물 커뮤니티 및 미생물 지역 사회 내에서 유전자 발현의 변동에 대한 유전자 발현이나 microarray 분…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 뷔르츠부르크 대학에서 감염증 연구 센터 (ZINF)에서 젊은 탐정 연구 프로그램으로 후원됩니다. 후안 C 가르시아-Betancur은 뷔르츠부르크 대학의 생명 과학 대학원 (GSLS)에서 박사 동료입니다.

Materials

Technique Name of the reagent Company Catalog number
MSgg composition potassium phosphate 5mM Roth 6878
MOPS 100mM Sigma-Aldrich M1254
Magnesium chloride 2mM Roth 2189.1
Calcium chloride 700μM Roth A119.1
Ferric chloride 50μM Sigma-Aldrich 157740
Zinc chloride 1μM Applichem A2076
Thiamine 2μM Sigma-Aldrich 74625
Glycerol 0.5% Roth 7533
Glutamate 0.5% Sigma-Aldrich 49621
Tryptophan 50μg/ml Sigma-Aldrich T0254
Phenylalanine 50μg/ml Sigma-Aldrich P2126
Cell fixation Paraformaldehyde Roth 0335
Name of the equipment Company Catalog number
Sonication Cell Sonicator Bandelin D-1000
Fluorescence Microscopy Fluorescence Microscope Leica DMI6000B
Name of the software Company Catalog Number
Fluorescence Microscopy AsaF Leica
Flow cytometry FCASDiva BD
Flow cytometry FlowJo Treestar
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References

  1. Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).
  2. Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).
  3. Kolenbrander, P. E. Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems. Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).
  4. O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
  5. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).
  6. Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Biofilms. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).
  7. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  8. Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
  9. Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. Biofilm-associated proteins. C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).
  10. O’Gara, J. P. ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).
  11. Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).
  12. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).
  13. Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation. PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).
  14. Kearns, D. B., Losick, R. Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis. Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).
  15. Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Paracrine signaling in a bacterium. Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).
  16. Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).
  17. Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media. J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).
  18. Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).
  19. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, 945-953 (2008).
  20. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).
  21. Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
  22. Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms. MBio. 1, (2010).
  23. Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).
  24. Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).
  25. Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).
  26. Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
  27. Hardwood, C. R., Cutting, S. M. . Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
  28. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).
  29. Yasbin, R. E., Young, F. E. Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1. J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).
  30. Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).
  31. Nakano, M. M. srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).
  32. Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. Cannibalism by sporulating bacteria. Science. 301, 510-513 (2003).
  33. Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).
  34. Shapiro, J. A. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).

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Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796, doi:10.3791/3796 (2012).
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